[發(fā)明專利]一種用于檢測可可球二孢的特異性引物及快速檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810386044.0
• 申請日: 2018-04-26
• 公開（公告）號: CN108531639B
• 公開（公告）日: 2019-07-19
• 發(fā)明（設計）人: 周游;黃俊生;楊臘英;汪軍;郭立佳;劉磊;梁昌聰
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 陳歡

本發(fā)明公開了一種快速檢測引起多種植物病害的病原菌可可球二孢(Lasiodiplodia theobromae)的特異性引物，以及用于設計特異性引物的變異區(qū)間。根據(jù)GenBank中包括Lasiodiplodia theobromae在內的葡萄座腔菌科真菌和其它種類真菌的翻譯延長因子基因(Transcription elongation factor,TEF)序列，發(fā)現(xiàn)了可用于設計L.theobromae特異性引物的變異區(qū)間，并基于該區(qū)間序列設計了特異性強的引物對ZYLTF1/ZYLTR1，該引物對僅可以從L.theobromae中特異擴增出一條216bp的條帶，而不能從其它物種中擴增出任何條帶。本發(fā)明還提供了所述引物對用于Lasiodiplodia theobromae的快速檢測方法，具有特異性好、靈敏度高且經(jīng)濟快速等優(yōu)點，此方法可快速、準確的檢測出L.theobromae是否存在，能在植物病害早期防控中起到關鍵作用。

技術領域

本發(fā)明涉及微生物檢測技術領域，具體涉及一種用于檢測可可球二孢的特異性引物及快速檢測方法。

背景技術

可可球二孢(Lasiodiplodia theobromae)生長速度快，傳播能力強，對環(huán)境適應性強，其在pH 4-9、溫度10-37℃范圍內均可生長。該病原菌寄主范圍廣，能造成龍眼、獼猴桃、芒果和板栗等果實腐爛，也能引起桉樹枝干潰瘍病、葡萄潰瘍病、橡膠木藍變、桃樹流膠病和鳳梨葉斑病等多種植物病害。

植物病害的快速識別是早期防治的關鍵。傳統(tǒng)的植物病害診斷方法只能在植物顯現(xiàn)病害癥狀后，分離純化病原菌并對病原菌進行鑒定才能確定病原，無法做到病害未顯癥時得知病原菌的侵染并及時進行防治。同時，分離病原菌后需要對病原菌進行形態(tài)或者分子鑒定，以便明確病原菌的分類地位。缺點在于，病原菌形態(tài)學鑒定易受到人為因素和培養(yǎng)條件的干擾導致鑒定錯誤。雖然近年來，基于核糖體轉錄間隔區(qū)序列(ITS)、翻譯延長因子序列(TEF)、微管蛋白序列(BT)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)等真核生物通用基因序列已被廣泛應用于植物病原真菌的鑒定。然而，利用通用引物鑒定病原菌需要分離純化病原菌，且PCR擴增結果需送樣測序及序列比對，才可確定病原菌分類地位。以上兩種病原菌分類方法耗時長，程序繁瑣，且常導致病害的誤診和防治延誤。所以，以病害癥狀為基礎的病害常規(guī)診斷技術不能做到病害發(fā)生前檢測，難以實施提前防治，不適合快速檢測的要求。因此迫切需要構建一套靈敏度高，操作簡便的快速檢測技術，實現(xiàn)植物病害的早期診斷。

利用特異性引物檢測病原菌僅通過PCR擴增是否產生目標條帶即可判斷是否有病原菌存在，具有簡便快捷和準確的優(yōu)點，已經(jīng)廣泛的應用于病害早期診斷。

發(fā)明內容

本發(fā)明目的在于提供一種用于檢測可可球二孢的特異性引物及快速檢測方法。該檢測方法不需要巢式PCR反應體系，可直接用總DNA為模板進行一次PCR擴增就能判定有無Lasiodiplodia theobromae，方便性得以提高。是一種很有應用前景的病原菌早期快速檢測和監(jiān)測技術，可為L.theobromae引起的植物病害診斷提供有力的技術保障。

本發(fā)明采取的技術方案如下：

一種用于檢測可可球二孢的特異性引物對，包括上游引物ZYLTF1和下游引物ZYLTR1，所述ZYLTF1和ZYLTR1的核苷酸序列分別為：

ZYLTF1：5'-acgcatgtcgttttttaa-3'，

ZYLTR1：5'-tacatgagtggtcagagcat-3'，

所述可可球二孢的拉丁名為Lasiodiplodia theobromae。

優(yōu)選的，所述引物通過以下方式得到：利用一段翻譯延長因子變異區(qū)間序列設計上游引物ZYLTF1，所述變異區(qū)間序列為：acgcatgtcgttttttaacccctctcga，并根據(jù)翻譯延長因子其它堿基序列設計下游引物ZYLTR1。