[發明專利]一種用于檢測可可球二孢的特異性引物及快速檢測方法

有效

• 申請號: 201810386044.0
• 申請日: 2018-04-26
• 公開（公告）號: CN108531639B
• 公開（公告）日: 2019-07-19
• 發明（設計）人: 周游;黃俊生;楊臘英;汪軍;郭立佳;劉磊;梁昌聰
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 陳歡

1.一種用于檢測可可球二孢的特異性引物對，其特征在于，包括上游引物ZYLTF1和下游引物ZYLTR1，所述ZYLTF1和ZYLTR1的核苷酸序列分別為：

ZYLTF1：5'-acgcatgtcgttttttaa-3'，

ZYLTR1：5'-tacatgagtggtcagagcat-3'，

所述可可球二孢的拉丁名為Lasiodiplodia theobromae；

所述引物通過以下方式得到：利用一段翻譯延長因子序列的變異區間序列設計上游引物ZYLTF1，所述變異區間序列為：acgcatgtcgttttttaacccctctcga，并根據翻譯延長因子其它堿基序列設計下游引物ZYLTR1。

2.根據權利要求1所述的一種用于檢測可可球二孢的特異性引物對，其特征在于，所述引物ZYLTF1和ZYLTR1對可可球二孢特異性擴增出216bp的產物。

3.一種可可球二孢快速檢測方法，其特征在于，以待測樣品的DNA為模板，利用權利要求1所述的引物對進行PCR擴增，反應結束后對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，根據擴增產物的大小判定結果，如果能特異性地擴增出216bp的產物，即判定樣品中存在可可球二孢。

4.根據權利要求3所述的一種可可球二孢快速檢測方法，其特征在于，所述待測樣品為可可球二孢或者疑似感染了可可球二孢的植物組織。

5.根據權利要求3所述的一種可可球二孢快速檢測方法，其特征在于，引物擴增的反應體系為：10μmol/L上游引物和下游引物各1μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，模板DNA 1μL，無菌超純水9.5μL；所述2×Taq PCR Master Mix包括0.05U/μL的Taq DNA聚合酶、10×Buffer、4mmol/L的Mg²⁺和0.4mmol/L的dNTPs。

6.根據權利要求3所述的一種可可球二孢快速檢測方法，其特征在于，擴增的反應程序為：

94℃預變性3min；94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min；循環35次；72℃終延伸10min。