[發明專利]肺癌的雙靶點CAR-T治療載體及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201810384081.8
• 申請日: 2018-04-26
• 公開（公告）號: CN108659133A
• 公開（公告）日: 2018-10-16
• 發明（設計）人: 田曉麗
• 申請（專利權）人: 上海怡豪生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/867;C12N15/66;C12N5/10;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

本發明涉及提供了肺癌的雙靶點CAR‐T治療載體及其構建方法和應用。雙靶點CAR?T治療載體由慢病毒表達載體pCDH?EF1α?MCS?(PGK?Puro)和CAR結構兩部分構成。所述的CAR結構具體為Igkappa?iRGD?CEAscFv–(G₄S)₅?GPC3V_H?(G₄S)₃?GPC3V_LscFv?CD8α?CD28?CD137?CD3ζ?T2A?CCL19。以病毒感染方式獲得含有該治療載體的T細胞，即CAR?T細胞(Chimeric Antigen Receptor T?Cell)，通過表達CAR結構，可靶向識別和殺傷肺癌細胞。

技術領域

本發明涉及一種CAR-T治療載體，尤其是涉及肺癌的雙靶點CAR-T治療載體及其構建方法和應用。

背景技術

目前，肺癌是全世界發病率與病死率最高的惡性腫瘤。按照組織學特點，肺癌可分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lungcancer，SCLC)。早期肺癌首選外科手術，中晚期患者多采取綜合治療模式，即指根據患者機體狀況、腫瘤細胞學、病理學類型和侵襲范圍(臨床分期)，有計劃應用手術、化療、放療和生物靶向等治療手段，以期達到根治或最大程度控制腫瘤、提高治愈率、改善患者生活質量、延長生存期的目的。現有治療模式下肺癌患者的總體治愈率<20％，晚期患者5年生存率＜5％。因此，探討新的治療模式非常重要。

CAR-T細胞療法是通過基因工程技術在T細胞表面人為過表達能識別特定的腫瘤表面抗原的單鏈抗體可變區基因片段，從而使T細胞識別特定抗原、殺傷表達該抗原的靶細胞。同時，由于CAR-T細胞是采用抗體識別抗原模式，因此不受主要組織相容性復合物(mainhistocompatibility complex，MHC)的限制。近年來，CAR-T細胞在血液腫瘤治療中取得了令人振奮的效果，如對晚期復發難治性急性淋巴細胞白血病(ALL)治療的完全緩解(CR)可達到90％，對慢性淋巴細胞白血病(CLL)和部分B細胞淋巴瘤的CR達到50％以上。在治療實體瘤方面，其安全性和有效性已得到證實。

中國專利CN107557388A公布了用于CAR-T細胞制備的慢病毒載體及其構建方法和在制備抗腫瘤細胞制品中的應用，同時還建立了熒光定量PCR檢測病毒滴度的方法，為臨床應用提供了檢測標準。

中國專利CN107446938A公布了一種特異性靶向受體蛋白MAGEA及其CAR-T載體的構建方法，所述構建方法包括，先提取抗骨肉瘤的單克隆雜交瘤細胞的RNA，然后用單克隆抗體的特異性引物進行RT-PCR，將抗體重鏈和輕鏈的可變區DNA片段克隆到T載體上，測序，獲得特異性識別腫瘤細胞的受體蛋白MAGEA，并將其表達序列克隆到CAR-T載體上，獲得特異性靶向MAGEA的新型CAR-T載體。該發明能夠為CAR-T細胞治療的實體腫瘤，尤其是在骨肉瘤的免疫治療上提供了有效的靶標。

中國專利CN107325185A公布了一種基于OCTS-CAR的PSCA及PDL1雙靶向嵌合抗原受體、編碼基因、OCTS-CAR-T重組表達載體及其構建方法和應用。該抗PSCA及PDL1雙靶向嵌合抗原受體包括依次串聯連接的CD8leader膜受體信號肽、雙抗原結合區、CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區、CD28嵌合受體共刺激因子、OX40嵌合受體共刺激因子以及TCR嵌合受體T細胞激活域，其中，雙抗原結合區包括以串聯或轉角連接方式連接的PSCA以及PDL1單鏈抗體的重鏈VH和輕鏈VL、抗體內鉸鏈Inner-Linker以及單鏈抗體間鉸鏈Inter-Linker。此外，還提供了編碼該抗PSCA及PDL1雙靶向嵌合抗原受體的基因，重組表達載體及其構建方法和應用。

上述專利均是關于CAR-T細胞療法的相關研究，但是目前缺少對于肺癌進行雙靶點CAR-T治療的載體或相關研究。

發明內容