[發明專利]肺癌的雙靶點CAR-T治療載體及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201810384081.8
• 申請日: 2018-04-26
• 公開（公告）號: CN108659133A
• 公開（公告）日: 2018-10-16
• 發明（設計）人: 田曉麗
• 申請（專利權）人: 上海怡豪生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/867;C12N15/66;C12N5/10;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

1.一種嵌合抗原受體，其特征在于，包括CEA單鏈抗體、GPC3單鏈抗體和趨化因子CCL19三個特異性結構，

其中，CEA單鏈抗體核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，

GPC3單鏈抗體，由GPC3單鏈抗體重鏈V_H、Inter-Linker、GPC3單鏈抗體輕鏈V_L三部分構成，其中，GPC3單鏈抗體重鏈V_H的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，Inter-Linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，GPC3單鏈抗體輕鏈V_L的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

趨化因子CCL19核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

2.根據權利要求1所述的一種嵌合抗原受體，其特征在于，嵌合抗原受體結構組成為Igkappa-iRGD-CEAscFv-(G₄S)₅-GPC3V_H-(G₄S)₃-GPC3V_LscFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ-T2A-CCL19。

3.根據權利要求2所述的一種嵌合抗原受體，其特征在于，

iRGD核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，

CEAscFv表示CEA單鏈抗體，

(G₄S)₅為單鏈抗體間鉸鏈Inner-Linker，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，

GPC3V_H表示GPC3單鏈抗體重鏈V_H，(G₄S)₃表示Inter-Linker，GPC3V_LscFv表示GPC3單鏈抗體輕鏈V_L，

CD8α為跨膜區，連接胞外抗原結合域和胞內信號域，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，

CD28-CD137為共刺激結構域，CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，CD137核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，

CD3ζ為信號轉導域，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，

T2A為linker，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

4.一種肺癌的雙靶點CAR-T治療載體，其特征在于，包含權利要求1-3中任一項所述嵌合抗原受體，以及載體。

5.根據權利要求4所述肺癌的雙靶點CAR-T治療載體，其特征在于，所述載體包括PUC19質粒、慢病毒表達載體。

6.根據權利要求5所述肺癌的雙靶點CAR-T治療載體，其特征在于，所述慢病毒表達載體為pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)。

7.一種如權利要求5或6所述肺癌的雙靶點CAR-T治療載體的構建方法，其特征在于，

將嵌合抗原受體結構按照基因序列，采用常規生物合成方法進行合成，合成后存在于PUC19質粒載體上；將PUC19質粒載體和慢病毒表達載體均采用ECoRⅠ、NotⅠ雙酶切，將酶切產物經過瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目的條帶，得出載體和目的片段的濃度，將兩者按照摩爾比為1:5進行連接轉化，質粒提取，最終獲得含有嵌合抗原受體結構的重組質粒，即所述肺癌的雙靶點CAR-T治療載體。

8.一種如權利要求5或6所述肺癌的雙靶點CAR-T治療載體的應用，其特征在于，用于構建CAR-T細胞，

將該治療載體采用三質粒包裝系統進行慢病毒包裝，組成為PSPAX2、pMD2G、肺癌的雙靶點CAR-T治療載體，使用293T細胞作為慢病毒的包裝細胞，培養，收集病毒液，將此病毒液濃縮后，感染T細胞，即可獲得CAR-T細胞。