[發明專利]利用免疫組化法檢測菠蘿胚珠減數分裂蛋白分布的方法

在審

• 申請號: 201810382004.9
• 申請日: 2018-04-26
• 公開（公告）號: CN108318697A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 趙麗華;秦源;侯志敏;劉麗萍;蔡漢陽;王路路
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種利用免疫組化法檢測菠蘿胚珠減數分裂蛋白分布的方法，其特征在于：所述方法包括如下：

（1）溶液的配制：

PBS溶液配制：

采用去離子水、KH₂PO₄和Na₂HPO₄·2H₂O配制PBS溶液，按以下步驟進行：

(1) 配制1/15mol/L KH₂PO₄，即每升水中溶解9.078克KH₂PO₄；

(2) 配制1/15mol/LNa₂HPO₄·2H₂O，即每升水中溶解11.876克Na₂HPO₄·2H₂O；

(3) 將體積分數18.2%KH₂PO₄溶液和81.8%Na₂HPO₄·2H₂O混合；

固定液：含4wt.%多聚甲醛的PBS溶液；

包埋液：30wt.% 聚丙烯酰胺200μl，25wt.%過硫酸銨2μl ，水197μl，TEMD 1μl，

酶解液：含1wt.% driselase、0.5wt.% cellulose、1wt.% pectolyase、1% BSA的PBS溶液；

（2）材料的獲得

取正在進行減數分裂的胚珠；

（3）材料固定

剝出花苞，用鑷子小心挑出，置于固定液中固定3-5小時；

（4）包埋

胚珠1×PBS溶液洗3遍，在載玻片上加1×PBS，再將胚珠置于其中，然后在解剖鏡下將包在胚珠外的組織去掉，換成包埋液，蓋上蓋玻片，輕輕壓散胚珠；室溫靜置20分鐘后，小心揭去蓋玻片；

（5）酶解

加50μl酶解液，蓋上封口膜，37℃濕盒中反應1小時；

（6）加一抗

揭膜后，用含0.2wt.%Triton-100的1×PBS溶液洗3次，每次15分鐘，按1:500的體積比，用1×PBS溶液稀釋一抗，加50μl一抗稀釋液，蓋上封口膜，4℃，8小時或者過夜孵育；

（7）加二抗

揭膜后，含0.2wt.%Triton-100的PBS溶液洗3次，每次15分鐘，按1:1000的體積比，用1×PBS稀釋二抗，加50μl二抗稀釋液，蓋上封口膜，4℃，8小時或者過夜孵育；

（8）制片后，Confocal顯微鏡拍照

揭膜后，含0.2wt.%Triton-100的PBS溶液洗3次，每次15分鐘，加PI染液，蓋上封口膜，室溫孵育20分鐘， PBS溶液洗2次，每次15分鐘；加防淬滅劑，蓋上蓋玻片，Confocal顯微鏡下觀察。

2.根據權利要求1所述的一種利用免疫組化法檢測菠蘿胚珠減數分裂蛋白分布的方法，其特征在于：所述的一抗為DMC1兔多克隆抗體；二抗為羊抗兔 IgG抗體。