[發明專利]利用免疫組化法檢測菠蘿胚珠減數分裂蛋白分布的方法

在審

• 申請號: 201810382004.9
• 申請日: 2018-04-26
• 公開（公告）號: CN108318697A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 趙麗華;秦源;侯志敏;劉麗萍;蔡漢陽;王路路
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明提供一種利用免疫組化法檢測菠蘿胚珠減數分裂蛋白分布的方法，利用擬南芥的減數分裂時期特異表達基因DMC1的抗體，經過精心調整溶液濃度，處理時間，及材料處理方式，利用激光共聚焦顯微鏡可以在胚珠中檢測到DMC1抗體的熒光，以此來觀察察菠蘿胚珠減數分裂過程重要基因DMC1在染色體上的表達情況。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種利用免疫組化法檢測菠蘿胚珠減數分裂蛋白分布的方法。

背景技術

種子是植物新一代生命的起始，能否正常發育為種子是植物界生命延續的關鍵（Walbot and Evans 2003）。植物雌配子體的發育直接關系著之后種子的形成，而大部分的種子植株在配子體發育過程中都會經歷減數分裂，將二倍體或高倍體的體細胞分裂形成單倍體或染色體數減半的配子體細胞，再經過有絲分裂發育為成熟的八核七細胞結構的胚囊，為之后的有性生殖及雙受精作用提供基礎（Maheshwari, 1950; Twell, 2011）。因此減數分裂過程是一個特殊且及其重要的過程。減數分裂過程一般發生在植物胚珠發育的早期，這一時期的胚珠基本還沒有內外珠被的包裹，一般來說其中遠離珠柄端的胚珠中心細胞膨大后進入減數分裂。減數分裂過程能不能完成直接關系雌配子體的能否正常發育（Nonomura et al., 2007）。

植物雌配子是胚珠中心一個細胞特化形成，一般很小，位于子房中，被子房壁所包裹，且數量較少。要對雌配子發育進行觀察比較困難，目前只對模式植物或重要農作物等的雌配子發育過程了解的比較多，特別是針對雌配子減數分裂的過程，非常少。常用的觀察雌配子減數分裂過程的主要有以下幾種方法：（1）染色體展片或壓片的方法：取正在進行減數分裂的胚珠，置于FAA（福爾馬林：乙醇：乙酸：水=1：0.5：5：3.5）中進行固定。過夜后，水洗3次加入酶解液，37℃反應半小時，水洗3次后，加10μL水后用鑷子夾碎后轉移至載玻片上，加-20℃預冷的冰醋酸展片，45℃烘干后加DAPI染色液后，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察。(2)苯胺藍染色觀察細胞板：取正在進行減數分裂的胚珠，置于FAA（福爾馬林：乙醇：乙酸：水=1：0.5：5：3.5）中進行固定。過夜后，換成苯胺藍染色液，染色過夜，于450%的甘油中制片，顯微鏡下觀察。（3）染色體免疫熒光：取正在進行減數分裂的胚珠，4%多聚甲醛固定1小時，蒸餾水洗3遍，加酶解液37℃反應半小時，蒸餾水洗3遍后，將材料置于載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，壓片后，在液氮中冰凍5分鐘后取出，小心快速的揭去蓋玻片，45℃烘干載玻片，之后加一抗孵育1小時，1X PBS緩沖液洗3次，每次15分鐘，再加二抗孵育1小時，洗1X PBS緩沖液洗3次，每次15分鐘，加DAPI染色液后，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察。

目前這些方法在研究植物雄配子體發育方面比較順利，使用的也較多，但是植物雌配子體因本身數量較少，而且每個雌配子均深埋于胚珠中，對于正在進行減數分裂的單個細胞來說獲取非常困難，以上的第1和3種方法在鏡檢時及其耗時間，而第二種方法只能觀察到減數分裂過程細胞板的變化，看不到染色體的形態變化，及其染色體上關鍵蛋白的變化。

發明內容

本發明解決非模式植物雌配子體發育過程中減數分裂相關基因蛋白分布情況，提供一種利用免疫組化法來觀察非模式植物菠蘿雌配子體進行減數分裂過程相關基因的蛋白分布情況的方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

（1）溶液的配制：

PBS溶液配制：

采用去離子水、KH₂PO₄和Na₂HPO₄·2H₂O配制PBS溶液，按以下步驟進行：

(1) 配制1/15mol/L KH₂PO₄，即每升水中溶解9.078克KH₂PO₄；