[發明專利]一種食源性益生菌的特異性熒光標記方法及其體內應用

在審

• 申請號: 201810380388.0
• 申請日: 2018-04-25
• 公開（公告）號: CN108524953A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 劉敬民;王碩
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: A61K49/00
• 分類號: A61K49/00;C09K11/66
• 代理公司: 天津合正知識產權代理有限公司 12229
• 代理人: 陳松

本發明涉及食源性益生菌的特異性熒光標記方法，包括以下步驟(a)通過溶劑熱?高溫煅燒法，制備具備近紅外熒光和超長余輝性質的Cr³⁺摻雜鎵鍺酸鋅長余輝熒光納米探針；(b)通過抗體表面功能化，實現納米探針對于目標益生菌的特異性熒光標記。本發明的有益效果在于：(1)本發明所制備的鎵鍺酸鋅長余輝納米探針具有超強近紅外發光和超長余輝壽命、優異的生物相容性和結構穩定性、良好的粒徑均一度和低毒性。(2)本發明所開發的近紅外熒光標記益生菌體內生物成像技術，可實現無損可視化地示蹤益生菌體進入生物體后的分布狀況，對于開辟創新型的食源性益生菌的功能位點及營養學研究理念具有重要意義。

技術領域

本發明屬于食源性益生菌的研究領域，涉及食源性益生菌的特異性熒光標記方法及其體內應用。

背景技術

益生菌，是腸道微生物菌群的重要部分，當它攝入足夠的數量時，會給消費者(宿主)健康帶來極大的益處。益生菌可極大的促進人體腸道健康，調節人體的免疫應答。盡管對人體健康具有極大的益處和特殊的功能，但體內與益生菌相關的代謝，分布和免疫調節還尚不十分明確，對大多數新物種的功能和活性作用仍然不夠明了，需要獲取更多的信息進行評估。

目前現代分子生物學技術如聚合酶鏈反應與變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)，實時定量PCR，DNA微陣列，焦磷酸測序和高通量測序等各種方法確定生物樣品的DNA序列，揭示益生菌的類型，分布和代謝。然而，上述技術通常需要收集大量樣本(糞便或體內組織)，設計探針/引物、對大量的數據進行統計分析，耗時耗力。此外，這些方法不能夠進行原位檢測，幾乎無法通過非破壞性和實時原位監測對生物體內益生菌分布狀況進行真實再現。因此，亟需建立一種能夠快速、直觀且具有非破壞性的實時原位監測技術，為益生菌在體內的分布及功能位點探究提供技術支撐。

針對以上研究方法需求和領域空白，我們引入了熒光成像技術。熒光成像作為探索腫瘤早期診斷治療的關鍵技術，是現今生物醫學領域和現代分析科學中的前沿方法，尤其是采用無創成像和微創體內生物成像在活體水平上非侵入式監測腫瘤的發生發展，對于癌癥的預防和早期診療具有重要的生命醫學研究意義和臨床應用價值。將這種無創成像技術應用到食源性微生物體內研究中，可以充分發揮熒光成像實時無損監測的優勢，進而可以系統性的研究益生菌進入生物體后的分布狀況和代謝行為。

熒光成像的影像效果依賴于造影劑(即熒光探針)的發光性能和靶向功能化。現代生物成像中的光學檢測要求(1)熒光探針的工作區域為生物透過窗口(700-1000nm和1100-1350nm)的近紅外光區工作以便增加檢測光的深組織透過率；(2)熒光探針的激發光不宜采用紫外光和可見光，以避免組織的自體熒光；(3)熒光探針的激發光強度不宜太強，以便降低背景信號，增大成像的信噪比；(4)能夠提供實時、整體、分布式的觀測結果。熒光納米探針不同于小分子成像造影劑或藥物，它不僅可以克服常規臨床腫瘤診斷技術存在的空間分辨率低、組織對比度低、準確性差、容易漏誤診等問題，還可以解決癌癥治療方法中化學療法存在的血液循環時間短、治療效率低、缺乏專一性、損害人體正常細胞等問題。近幾年來基于不同的光物理化學性能，研究者逐漸提出了幾種不同的熒光探針，包括：熒光編碼蛋白、有機染料、半導體量子點、貴金屬納米粒子、碳納米材料以及上轉換發光材料。然而這些材料都在不同程度上有著各自的缺陷，例如信噪比差、缺乏光學穩定性、光漂白、相干光激發、發光強度不穩定等。