[發明專利]一種翹嘴鲌親子鑒定微衛星熒光多重PCR的方法

有效

• 申請號: 201810379963.5
• 申請日: 2018-04-25
• 公開（公告）號: CN108611405B
• 公開（公告）日: 2022-02-15
• 發明（設計）人: 劉士力;賈永義;顧志敏;蔣文枰;遲美麗;程順;鄭建波;李飛
• 申請（專利權）人: 浙江省淡水水產研究所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 裴金華

本發明涉及一種翹嘴鲌親子鑒定微衛星熒光多重PCR的方法，首先篩選出16對SSR引物，通過優化組合選出12對組成3個多重PCR組；然后在一個PCR反應體系中加入同屬一組但濃度不同的4對SSR特異性引物對，采用不同的反應體系同時對同一個DNA模板的不同區域擴增出多個目的片段；通過電泳抽樣檢測后送生物公司在測序儀上進行分型，并獲取樣本相應位點的基因型；最終用于分析親本和子代的親子關系。本發明涉及的微衛星標記的擴增體系，節約DNA樣本，實驗效率高，可在翹嘴鲌的親子鑒定、種群遺傳多樣性和遺傳結構的評估方面進行推廣。

技術領域

本發明屬于水產養殖領域中的水產動物種質鑒定技術，具體涉及一種翹嘴鲌親子鑒定微衛星熒光多重PCR的方法，利用多重PCR對翹嘴鲌進行SSR分析的方法，適合在翹嘴鲌選育和養殖過程中進行種質鑒定和系譜管理。

背景技術

翹嘴鲌(Culter alburnus Basilewsky)是鲌亞科中體型最大的一種魚類，隸屬于鯉科(Cyprinida)、鲌亞科(Culterinae)、鲌屬(Culter)，廣泛分布于中國各大水系。太湖中出產的翹嘴鲌被譽為“太湖三白”之一，其肉白而細嫩，味美而不腥。此外，翹嘴鲌在淡水水域生態系統中處于食物鏈的頂端，對維持生態系統的穩定具有重要作用。

分子標記是種質資源鑒定、家系選育和放流效果評估等研究和應用中一個重要技術手段。在家系選育中，了解整個家系遺傳多樣性，子代與親代的對應關系以及子代與子代的關系，可以指導親本選留，從而避免近親繁殖，對于預防種質衰退具有重要作用。

微衛星DNA是真核生物基因組中短的串聯重復序列。由于微衛星位點數量多，在基因組中均勻分布，共顯性遺傳且易于檢測，微衛星DNA得到了廣泛的應用。翹嘴鲌的微衛星已用來解決遺傳多樣性、遺傳結構等問題。但是，上述遺傳學實驗均需要采用多個微衛星位點，研究者需要花費大量的時間和實驗成本。更重要的是，要消耗較多的DNA樣本。故發明一種對樣本量要求少、成本低、高效的微衛星實驗體系對于翹嘴鲌的育種研究來說具有重要的意義。

目前，其它物種的微衛星遺傳學研究中采用多重PCR以解決上述問題。微衛星多重PCR指在一個PCR體系中加入多對微衛星特異性引物，對同一個模板的不同區域進行同時擴增的PCR技術。微衛星多重PCR可以同時擴增多個目的片段，能夠達到節約實驗樣品、實驗成本、提高實驗效率的目的。微衛星多重PCR的核心內容在于如何設計和優化引物組合，使得引物之間不存在相互作用、不產生非特異擴增、不使擴增產物重疊。盡管微衛星多重PCR技術已在其他物種中廣泛得到應用，但是迄今為止，翹嘴鲌微衛星多重PCR體系仍末建立起來。

發明內容

本發明的目的在于提供一套高效的翹嘴鲌微衛星位點的四重PCR體系的檢測方法，該方法選用有效的微衛星引物，可靠、高效，能對翹嘴鲌進行親子鑒定，還能用于家系管理和增殖放流效果評估。

本發明的上述目的是通過如下技術方案來實現的：一種翹嘴鲌親子鑒定微衛星熒光多重PCR的方法，首先篩選出16對SSR引物，通過優化組合選出12對組成3個多重PCR組；然后在一個PCR反應體系中加入同屬一組但濃度不同的4對SSR特異性引物對，采用不同的反應體系同時對同一個DNA模板的不同區域擴增出多個目的片段；通過電泳抽樣檢測后送生物公司在測序儀上進行分型，并獲取樣本相應位點的基因型；最終用于分析親本和子代的親子關系。

具體地，本發明技術方案包括以下步驟：

（1) 翹嘴鲌樣本DNA提取

取翹嘴鲌個體的鰭條，采取酚—氯仿法提取基因組DNA，將獲得的DNA測定濃度后稀釋至約50ng/μl。

（2) 翹嘴鲌多態性微衛星序列的篩選