[發(fā)明專(zhuān)利]一種翹嘴鲌親子鑒定微衛(wèi)星熒光多重PCR的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810379963.5
• 申請(qǐng)日: 2018-04-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108611405B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉士力;賈永義;顧志敏;蔣文枰;遲美麗;程順;鄭建波;李飛
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江省淡水水產(chǎn)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/686
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/686
• 代理公司: 浙江千克知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33246
• 代理人: 裴金華

1.一種翹嘴鲌親子鑒定微衛(wèi)星熒光多重PCR的方法，包括以下步驟：

（1)翹嘴鲌樣本DNA提取

取翹嘴鲌個(gè)體的鰭條，采取酚—氯仿法提取基因組DNA，將獲得的DNA測(cè)定濃度后稀釋至約50ng/μl；

（2)翹嘴鲌多態(tài)性微衛(wèi)星序列的篩選

用步驟(1)獲得的基因組DNA為模板，根據(jù)Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)微衛(wèi)星位點(diǎn)引物，合成引物，并通過(guò)對(duì)翹嘴鲌個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出16對(duì)引物，所述引物包括正向引物、反向引物；

（3)對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)多重PCR擴(kuò)增效果摸索、確定

進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增：對(duì)步驟（2) 中篩選得到的16對(duì)引物按照擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物按照120-180bp、200-260bp、280-340bp、360-420bp四個(gè)不同區(qū)間進(jìn)行初步分組；首先兩兩組合，選出擴(kuò)增清晰的組合，再依次進(jìn)行3個(gè)和4個(gè)位點(diǎn)的多重PCR體系的構(gòu)建；最終獲得由12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)組成的3組4重 PCR體系，將每個(gè)位點(diǎn)上游引物的5'端進(jìn)行熒光修飾，然后，對(duì)所有親本和子代DNA樣本進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；所述的3組4重PCR體系的引物信息如下所示：

第一組引物信息：

Cal018位點(diǎn)的引物為：上游引物：ATGAACACAACTTACC（5'-3'）、下游引物CAAGGACAAGGATTATG（5'-3'）；

Cal029位點(diǎn)的引物為：上游引物：TACTGAGTGAGAAACCTTTCC（5'-3'）、下游引物：AACTACCAATGCCTGATTCC（5'-3'）；

Cal006位點(diǎn)的引物為：上游引物：GCGTATTCCTCTCCTGATTC（5'-3'）、下游引物AGATGTCGTGGTTAGTTTCA（5'-3'）；

Cal019位點(diǎn)的引物為：上游引物：GTATAACACAGAATGACACAGG（5'-3'）、下游引物：TTCACGCACTTCAAACACT（5'-3'）；

第二組引物信息：

Cal050位點(diǎn)的引物為：上游引物：AAGTAGAGCGAGCAGAGA（5'-3'）、下游引物GAGAGCATTCAGGAAGCA（5'-3'）；

Cal053位點(diǎn)的引物為：上游引物：CCATATCCAGCACTCTAACA（5'-3'）、下游引物TCATCAACTCTCACACTCTC（5'-3'）；

Cal049位點(diǎn)的引物為：上游引物：TGTGTCGTGATGGAGGAG（5'-3'）、下游引物GCGGTGTTCTGCTTCTTC（5'-3'）；

Cal054位點(diǎn)的引物為：上游引物：TGGCACAACAACACAGAC（5'-3'）、下游引物AGACCTCCTCCTCTTCTC（5'-3'）；

第三組引物信息：

Cal052位點(diǎn)的引物為：上游引物：ACCTGTCCACCTCAATCA（5'-3'）、下游引物GAATCTGCCGTTCTCACTA（5'-3'）；

Cal046位點(diǎn)的引物為：上游引物：TTGGACTGAGAGAAGGAAAT（5'-3'）、下游引物AAGAGACTGAACATTGAAGC（5'-3'）；

Cal017位點(diǎn)的引物為：上游引物：ACCGCAACATTACAAAGAC（5'-3'）、下游引物GCATAGTGACATCATAGCAT（5'-3'）；

Cal001位點(diǎn)的引物為：上游引物：CCTGCTATTGTTTCTTTCATCC（5'-3'）、下游引物TTCCATATCCTCTCATCCTTCA（5'-3'）；

4)獲取翹嘴鲌樣本的基因型數(shù)據(jù)。