[發明專利]一種煙草根黑腐病菌的分離方法

在審

• 申請號: 201810379716.5
• 申請日: 2018-04-25
• 公開（公告）號: CN108384725A
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發明（設計）人: 康業斌;李淑君;趙世民;康蕾;葉紅朝;周俊學;董昆樂;孔德輝;王玉潔;馬君紅;李成軍;王海濤;陳玉國;白靜科;丘睿
• 申請（專利權）人: 河南科技大學;河南省農業科學院煙草研究所;河南省煙草公司洛陽市公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/02;C12R1/645
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 孫笑飛

一種煙草根黑腐病菌的分離方法，采集具有煙草根黑腐病癥狀的煙草植株的根際土壤，將采集的根際土壤干燥磨碎后粘附于胡蘿卜片上，然后將粘附有土壤的胡蘿卜片放置在培養皿中培養2—4天，之后用加有50μL/mL青霉素和50μL/mL硫酸鏈霉素的無菌水沖洗胡蘿卜片，繼續培養2—4天后，挑取胡蘿卜片上具有煙草根黑腐病典型病癥的霉層，純化培養后保存。利用胡蘿卜片成分對煙草根黑腐病菌和其它真菌的不同影響，誘導煙草根黑腐病菌生長而抑制其它菌的生長，解決煙草根黑腐病菌易被其它真菌掩蓋的問題。處理后的胡蘿卜圓片表面可很快長出菌絲與典型的分生孢子梗、分生孢子及厚垣孢子，成功率達96%以上。

技術領域

本發明涉及一種病菌分離方法，具體地說是一種煙草根黑腐病菌的分離方法。

背景技術

植物病原真菌的分離、純化培養不僅是進行病原真菌的形態學觀察、致病性測定、生理生態與分子生物學等理論性研究的基礎，也是進行品種抗病性鑒定和篩選、病原菌耐（抗）等應用性研究的基礎。植物患病組織內的真菌菌絲體，如果給予適宜的環境條件，一般都能恢復生長和繁殖。然而，在自然情況下，病原菌通常是與其他雜菌混生在一起的，從受病組織或其它基物中將病原菌單獨分離出來，稱作植物病原真菌的分離。植物病原真菌的分離不僅在植物病理學研究工作中具有十分重要的位置，而且對分離到的病原真菌進行保存可以滿足植物病理學及微生物學日常的教學需要，使學生對植物病原真菌有更直觀的認識。

煙草根黑腐病由根串珠霉(Thielaviopsis basicola) 侵染引起，在我國云南、貴州、四川、重慶、湖北、河南、山東、安徽、福建和吉林等省也均有發生，重病煙田發病率達30%以上。由于串珠霉與煙草寄生疫霉（Phytophthora spp.）、腐霉菌（Pythium spp.）、鐮刀菌（Fusarium spp.）、絲核菌（Rhizoctonia spp.）等病原真菌復合侵染引起煙草根莖部病害，給生產上準確診斷病害造成困難，明確本地病原菌的種類及其致病力是指導病害防治以及進行后續研究的基礎。

目前，從染病植株上分離病原菌通常采用組織分離法，在病株發病部位的病、健交界處切下4-5塊3×3mm的組織小塊，分離過程中需要依次用70%酒精（或0.1%升汞）及3%-5%次氯酸鈉消毒，還需要用無菌水多次清洗，以及用濾紙吸干離。用酒精和次氯酸鈉消毒，以及無菌水清洗時都需要用到培養皿，每次消毒及清洗培養皿均需更換一次，1個病株需要5副培養皿才可以分離完畢，操作過程復雜，而且所需耗材及試劑多，成本較高。

而且，由于煙草根黑腐病菌屬于兼性寄生真菌，且與腐霉菌等其它幾類真菌相比生長速度較慢，采用常規的病組織分離法分離極容易被其它真菌掩蓋，很難獲得純培養病原物。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服常規分離方法所需耗材及試劑多，難以獲得純培養病原物的缺陷，提供一種煙草根黑腐病菌的分離方法。

本發明為解決上述技術問題所采用的技術方案是：一種煙草根黑腐病菌的分離方法，采集具有煙草根黑腐病癥狀的煙草植株的根際土壤，將采集的根際土壤干燥磨碎后粘附于胡蘿卜片上，然后將粘附有土壤的胡蘿卜片放置在培養皿中培養2—4天，之后用加有50μL/mL青霉素和50 μL/mL硫酸鏈霉素的無菌水沖洗胡蘿卜片，繼續培養2—4天后，挑取胡蘿卜片上具有煙草根黑腐病典型病癥的霉層，純化培養后保存。

進一步地，所述的根際土壤為距煙草根系表面2 mm以內的土壤。

進一步地，所述的胡蘿卜片的厚度為4-6 mm。

進一步地，所述的胡蘿卜片為新鮮胡蘿卜用濃度75%酒精進行表面消毒后，使用滅菌刀切成的圓片。

進一步地，先在培養皿中鋪設浸過蒸餾水的脫脂棉及濾紙，然后再將粘附有土壤的胡蘿卜片放于其中培養。