[發明專利]用于結直腸癌相關基因甲基化的檢測方法、試劑盒及應用

在審

• 申請號: 201810379698.0
• 申請日: 2018-04-25
• 公開（公告）號: CN108642178A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 趙杰;李艷紅;單嘉杰
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 黃瑩

本發明提供了用于結直腸癌相關基因甲基化的檢測方法、試劑盒及應用。本發明涉及了用于檢測LAD1基因甲基化的特異性引物對和探針，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1～4所示。本發明還提供了所述的特異性引物對和/或探針的應用、檢測LAD1基因甲基化試劑盒和LAD1基因甲基化檢測方法。本發明的檢測方法具有高通量特性和高敏感性，且無需在PCR后進行電泳和分子雜交等操作，可減少實驗過程中污染和操作誤差，還能節約時間和節省試劑消耗，不僅能減少檢測成本，提高檢測效率，將為結直腸癌早期診斷和無創快速篩查提供有效手段，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，特別涉及用于結直腸癌相關基因甲基化的檢測方法、試劑盒及應用。

背景技術

由于現有的結直腸癌篩查方法，如結腸鏡檢查、糞便sDNA檢查、血清癌胚抗原(CEA)水平檢查，存在效率低、準確性低或侵入性的特點，導致結直腸癌患者不能及時得到診斷，多數結直腸癌患者被發現時已經處于發展晚期，治療和預后效果不佳。因此，尋找一種簡單、安全、特異性高、靈敏性高的早期篩查方法是當前結直腸癌預防和治療的關鍵。

DNA甲基化(DNA methylation)作為重要的表觀遺傳修飾之一，它與腫瘤的發生發展關系密切。狹義的DNA甲基化指由DNA甲基轉移酶(DNA methyhransferase，DNMT)介導，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將一個甲基基團共價結合到胞嘧啶(Cytoine，Cyt)環5位碳上，成為5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)的化學修飾過程。DNA甲基化通常發生于CpG二核苷酸中，對基因的表達和調控有重要作用。目前，DNA甲基化已應用于腫瘤機制和診治研究。結直腸癌的DNA甲基化研究中主要采用的是腫瘤組織，但是由于獲取難度大，腫瘤組織樣品并不適用于廣泛篩查和早期診斷。研究者們嘗試從非侵入性生物樣品(如血液)中尋找生物標志物。此類樣品具有適合大量樣本收集、操作及處理簡便等優點，其DNA甲基化有望成為非侵襲性腫瘤標志物來源，以更好地運用于臨床。

由于一些抑癌基因異常甲基化常發生在腫瘤形成的開始，可運用于早期檢測。而混雜因素可能導致檢測的假陽性，早期檢測最關鍵的問題是區分非腫瘤如年齡、飲食等相關的甲基化與腫瘤特異甲基化，設計研究方案時應考慮各種混雜因素或選用獨立個體。盡管目前已有一些抑癌基因如SPG20、FBN1、VIM等甲基化檢測用于結直腸癌的早期診斷，但往往會出現特異性或靈敏性不強的特點。

目前常用來進行檢測基因甲基化的方法有甲基化特異性PCR(MS-PCR)、亞硫酸氫鹽處理和測序等方法。MS-PCR方法經濟實用，無需特殊儀器，因此是目前應用最為廣泛的方法。在亞硫酸氫鹽處理后，即可開展MS-PCR。在傳統的MSP方法中，通常設計兩對引物，一對MSP引物擴增經亞硫酸氫鹽處理后的DNA模板，而另一對擴增未甲基化片段。若第一對引物能擴增出片段，則說明該檢測位點存在甲基化，若第二對引物能擴增出片段，則說明該檢測位點不存在甲基化。這種方法靈敏度高，可用于石蠟包埋樣本，且不受內切酶的限制。不過也存在一定的缺陷，需要預先知道待測片段的DNA序列，并設計出好的引物，這至關重要。另外，若存在亞硫酸氫鹽處理不完全的情況，那可能導致假陽性。亞硫酸氫鹽處理和測序一度被認為是DNA甲基化分析的金標準。它的過程如下：經過亞硫酸氫鹽處理后，用PCR擴增目的片段，并對PCR產物進行測序，將序列與未經處理的序列進行比較，判斷CpG位點是否發生甲基化。這種方法可靠，且精確度高，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態，但需要大量的克隆測序，過程較為繁瑣、昂貴。

因此，甲基化檢測特異性或靈敏性不強等技術問題還有待解決。

發明內容

本發明的第一目的在于克服現有技術的缺點與不足，為改善甲基化檢測特異性或靈敏性不強等問題，提供用于檢測LAD1基因甲基化的特異性引物對和探針。

本發明的第二目的在于提供所述的特異性引物對和探針的應用。

本發明的第三目的在于提供用于檢測LAD1基因甲基化的試劑盒。