[發明專利]用于篩選檢定黃曲霉毒素B1降解菌的培養基及篩選檢定方法

在審

• 申請號: 201810378524.2
• 申請日: 2018-04-25
• 公開（公告）號: CN108588170A
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發明（設計）人: 張智猛;王明清;孫杰;張初署;戴良香
• 申請（專利權）人: 山東省花生研究所
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04
• 代理公司: 青島發思特專利商標代理有限公司 37212
• 代理人: 鞏同海

1.一種用于篩選檢定黃曲霉毒素B1降解菌的培養基，其特征在于，所述培養基為香豆素液體培養基和/或香豆素固體培養基，香豆素液體培養基的成分為：KH₂PO₄ 0.25g/L、MgSO₄·7H₂O 0.25g/L、KNO₃ 0.5g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L、CaCl₂ 0.005g/L、FeCl₃·6H₂O0.003g/L、pH 7.0；121℃高壓滅菌20min后加入已消毒殺菌的香豆素溶液至1g/L；香豆素固體培養基的成分為：在香豆素液體培養基的基礎上加入20g/L瓊脂。

2.一種用于降解黃曲霉毒素B1的菌株的篩選檢定方法，其特征在于，包括培養和鑒定兩個步驟，培養以香豆素為唯一碳源，經初選和純化后得到初篩菌株，然后加入AFB₁標準品對AFB₁進行降解；鑒定采用HPLC進行測定，對土壤中是否含有用于降解黃曲霉毒素B1的菌株進行檢定；

所述初篩菌株的培養過程包括：

步驟一：采集花生主產區的土壤樣品保存備用；

步驟二：將采集到的土壤樣品用無菌水混勻稀釋，接種到香豆素液體培養基上培養；菌液渾濁后涂布在香豆素固體培養基上培養；

步驟三：挑選單菌落在LB固體培養基上多次劃線純化培養；

步驟四：純化后的菌株在LB液體培養基上培養；

所述鑒定方法包括：

(1)純化后的初篩菌株接種于發酵培養基，向發酵菌液中加入AFB₁標準品后培養；

(2)對AFB₁的降解率采用HPLC進行測定，從而檢定土壤中是否含有用于降解黃曲霉毒素B1的菌株。

3.根據權利要求2所述的篩選檢定方法，其特征在于，若土壤中含有用于降解黃曲霉毒素B1的菌株，則對該菌株進行形態及生理生化鑒定。

4.根據權利要求3所述的篩選檢定方法，其特征在于，所述形態鑒定方法為將菌株接種在LB固體培養基，37℃培養2d后觀察菌落顏色、形態，進行革蘭氏染色；所述生理生化鑒定方法為使用API20NE試劑盒分析菌株的生理生化特征。

5.根據權利要求2、3或4所述的篩選檢定方法，其特征在于，所述LB液體培養基的成分為：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、pH 7.0；LB固體培養基的成分為：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂20g/L、pH 7.0。

6.根據權利要求2、3或4所述的篩選檢定方法，其特征在于，所述發酵培養基的成分為：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、NaCl 10g/L、KH₂PO₄ 1g/L、葡萄糖1g/L、pH 7.0。

7.根據權利要求2、3或4所述的篩選檢定方法，其特征在于，所述步驟二中：香豆素液體培養基上的培養條件為：150rmp、37℃培養10～15d；香豆素固體培養基上的培養條件為：37℃培養箱中培養。

8.根據權利要求2、3或4所述的篩選檢定方法，其特征在于，所述步驟四中：LB液體培養基上的培養條件為：37℃培養10～15d。

9.根據權利要求2、3或4所述的篩選檢定方法，其特征在于，所述步驟(1)中：AFB₁標準品的加入方法為：980μL發酵菌液加入20μL、5mg/kg的AFB₁標準品，使發酵液中AFB₁終濃度為100μg/kg。

10.根據權利要求2、3或4所述的篩選檢定方法，其特征在于，所述步驟(2)中：HPLC檢測條件為：Agilentl 260高效液相色譜儀，C-18色譜柱，流動相為甲醇：水＝1:1(V/V)，流速0.8mL/min，熒光檢測器激發波長為360nm，發射波長為440nm。