[發明專利]重組基因工程菌發酵合成L-乳酸的方法

在審

• 申請號: 201810376571.3
• 申請日: 2018-04-25
• 公開（公告）號: CN108660165A
• 公開（公告）日: 2018-10-16
• 發明（設計）人: 胡曉;馬明超;胡曼曼;李明同;安明;孫永先;王玉成;王理想
• 申請（專利權）人: 安徽瑞賽生化科技有限公司
• 主分類號: C12P7/56
• 分類號: C12P7/56;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了重組基因工程菌發酵合成L?乳酸的方法，是將乳桿菌屬乳酸脫氫酶基因Idhl整合進光滑球擬酵母菌基因MTⅡa,形成重組DNA基因IdhⅡa。通過PCR克隆，并經修飾后插入大腸桿菌表達載體pTE28aT7構建L?乳酸工程菌pTE28aT7?IdhⅡa；在異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導下，在含有葡萄糖的限制培養基中，經發酵合成L?乳酸；通過過濾發酵液、有機溶劑萃取結晶和組合溶劑重結晶獲得產品L?乳酸。本發明的重組基因工程菌發酵合成L?乳酸的方法簡明、產量高、成本低廉，在L?乳酸的微生物法制備中發揮重要的作用，應用前景廣闊。

技術領域：本發明屬于微生物發酵技術領域，涉及重組基因工程菌發酵合成L-乳酸的方法。

背景技術

L-乳酸是重要的有機合成中間體，可用于基礎生物基原料、醫藥原料、農藥、化妝品、多功能添加劑等行業，特別是近年發展起來的聚酯和可降解塑料等產業擴大了L-乳酸的用途。

L-乳酸的制備方法主要有（1）發酵法：以含有淀粉的原料蔗糖、甜菜糖或其糖蜜為原料。糖化接入乳酸菌株。pH控制在5-5.5，溫度50℃左右發酵3-4d，用碳酸鈣使生成的乳酸轉化為乳酸鈣。并經中和、過濾、濃縮、脫色和重結晶等獲得L-乳酸，原料消耗定額:大米2080kg/t、硫酸(98%)530kg/t。（2）乙醛氫氰酸法：以乙醛為原料與氫氰酸反應生成乳腈，再經水解得到粗乳酸。粗乳酸與乙醇酯化生成乳酸酯，再經分解成乳酸。再經水解、酯化、精餾等過程獲得產品，原料消耗定額:乙醛480kg/t、氫氰酸290kg/t、硫酸1040kg/t。（3）丙烯腈法：以丙烯腈為原料與硫酸反應生成粗乳酸，再與甲醇反應生成乳酸甲酯，經蒸餾得粗酯，將精酯加熱分解得乳酸。再經酸化、酯化、精餾和重結晶等獲得產品。原料消耗定額:丙烯腈780kg/t、硫酸(98%)1030kg/t。本發明是將乳桿菌屬乳酸脫氫酶基因Idhl整合進光滑球擬酵母菌基因MTⅡa,形成重組DNA基因IdhⅡa。通過PCR克隆該重組基因，并經修飾后插入大腸桿菌表達載體pTE28aT7構建L-乳酸工程菌pTE28aT7-IdhⅡa；在異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導下，在含有葡萄糖的限制培養基中，經發酵合成L-乳酸；通過過濾發酵液、有機溶劑萃取結晶和組合溶劑重結晶獲得產品L-乳酸。合成工藝路線簡捷，既節能又環保，所獲得的產品質量高和成本低，總質量收率達到68.49%以上。

發明內容

本發明的目的在于提供重組基因工程菌發酵合成L-乳酸的方法。

本發明通過下述方法實現的：

將乳桿菌屬乳酸脫氫酶基因Idhl整合進光滑球擬酵母菌基因MTⅡa,形成重組DNA基因IdhⅡa。通過PCR克隆該重組基因，并經修飾后插入大腸桿菌表達載體pTE28aT7構建L-乳酸工程菌pTE28aT7-IdhⅡa；在異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導下，在含有葡萄糖的限制培養基中，經發酵合成L-乳酸；通過過濾發酵液、有機溶劑萃取結晶和組合溶劑重結晶獲得產品L-乳酸。

質粒子及菌株：

菌株和質粒: 乳桿菌屬乳酸脫氫酶（購自上海生工生物工程有限公司），光滑球擬酵母菌（購自上海基米生物技術有限公司），大腸桿菌(Escherichia coli ) JM109, 大腸桿菌質粒pTE28aT7（中國醫學科學院醫藥生物技術研究所王玉成教授提供）。

培養基:LB,YEPD,YNB培養基，細菌常用培養基：MD、YPD、BMGY、 BMMY培養基，重組酵母常用培養基。

試劑和酶:質粒小量提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，膠回收試劑盒購自TaKaRa公司，限制性核酸內切酶BamHI 、Eco RI和T4 ligase連接酶購自Promega公司。酵母無氨基基本氮源培養基(YNB)，遺傳霉素G418購自上海生工生物工程有限公司。其他試劑為國產分析純。