[發(fā)明專利]重組基因工程菌發(fā)酵合成L-乳酸的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810376571.3
• 申請日: 2018-04-25
• 公開（公告）號: CN108660165A
• 公開（公告）日: 2018-10-16
• 發(fā)明（設計）人: 胡曉;馬明超;胡曼曼;李明同;安明;孫永先;王玉成;王理想
• 申請（專利權）人: 安徽瑞賽生化科技有限公司
• 主分類號: C12P7/56
• 分類號: C12P7/56;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.本發(fā)明涉及重組基因工程菌發(fā)酵合成L-乳酸的方法，包括：

（1）是將乳桿菌屬乳酸脫氫酶基因Idhl整合進光滑球擬酵母菌基因MTⅡa,形成重組DNA基因IdhⅡa；

（2）通過PCR擴增，并經修飾后插入大腸桿菌表達載體pTE28aT7，構建L-乳酸工程菌pTE28aT7-IdhⅡa；

（3）在異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導下，采用高通量篩選法篩選高效菌株；

（4）在含有葡萄糖的限制培養(yǎng)基中，經發(fā)酵合成L-乳酸，通過過濾發(fā)酵液、有機溶劑萃取結晶和組合溶劑重結晶獲得產品L-乳酸。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于乳桿菌屬乳酸脫氫酶基因Idhl整合進光滑球擬酵母菌基因MTⅡa,形成重組DNA基因IdhⅡa。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于PCR擴增條件為：95℃預變性10min，91℃變形60s，56℃退火30s，70℃延伸80-120s，30個循環(huán)后70℃延伸15min。

4.根據權利要求1所述的重組工程菌發(fā)酵合成L-乳酸的方法，包括：

（1）對所述重組工程菌在含有葡萄糖限制性培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，采用高通量篩選；

（2）過濾發(fā)酵液、有機溶劑萃取結晶和組合溶劑重結晶獲得產品L-乳酸。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于重組基因工程菌發(fā)酵合成L-乳酸的發(fā)酵階段發(fā)酵條件為溫度30℃～35℃、110r/min振蕩培養(yǎng)68h,當底物葡萄糖濃度為27.8 %，發(fā)酵液pH5.5～6.0，溫度為25-35 ℃，加酶量為每克葡萄糖33U，添加1 mmol/L的K⁺,轉化周期為68 h,實現L-乳酸過量表達23.50g/L。

6.根據按照權利要求4所述的方法，其特征在于發(fā)酵液先經過濾分離催化酶重復使用，利用乙酸丁酯萃取濾后發(fā)酵液，再將萃取液濃縮結晶后，利用乙酸丁酯與石油醚按體積比1：3～5的組合溶劑重結晶，獲得產品L-乳酸。