[發(fā)明專利]降低表達(dá)文庫(kù)假陰性率的膜系統(tǒng)建庫(kù)方案

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810375612.7
• 申請(qǐng)日: 2018-04-24
• 公開（公告）號(hào): CN110396726A
• 公開（公告）日: 2019-11-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王樹偉;趙仕蘭;肖云平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類號(hào): C40B50/06
• 分類號(hào): C40B50/06
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本發(fā)明涉及降低膜體系表達(dá)文庫(kù)假陰性率的一種建庫(kù)方案，包括增加用于反轉(zhuǎn)錄的起始總RNA量并分離mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；增加文庫(kù)接頭的種類。本發(fā)明改變了建庫(kù)過程中的反轉(zhuǎn)錄使用的RNA種類及接頭種類，降低了膜體系表達(dá)文庫(kù)的假陰性率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及表達(dá)文庫(kù)制備領(lǐng)域，具體涉及一種用于降低膜體系表達(dá)文庫(kù)假陰性率的一種建庫(kù)方案。

背景技術(shù)

酵母雙雜交(Yeasttwo hybrid)技術(shù)是由Fields和Song等最早建立的一種用于研究真核生物蛋白相互作用的一種技術(shù)，目前已被廣泛應(yīng)于蛋白質(zhì)組學(xué)功能、基因組學(xué)及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等領(lǐng)域。該方法既可以用于檢測(cè)已知蛋白之間的相互作用，也可以用來發(fā)現(xiàn)與已知蛋白相互作用的未知蛋白。

酵母雙雜交的技術(shù)原理主要是基于酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，GAL4是組件式的(modular)，由兩個(gè)或兩個(gè)以上的結(jié)構(gòu)域組成，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上能夠分開，功能上也是互相獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域(domain)。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別是DNA結(jié)合功能域(DNA bindingdomain，DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation doman，DNA-AD)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在分開時(shí)雖然仍然分別具有各自的功能，但是分開時(shí)由于空間上的距離導(dǎo)致兩者不能共同作用從而不能激活轉(zhuǎn)錄，但是當(dāng)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，就可以呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，從而能激活上游激活序列(Upstream activating sequence，UAS)的下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。

根據(jù)這個(gè)特性，將編碼DNA-BD的基因與編碼誘餌蛋白(Bait protein)的基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上，在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白BD-Bait protein；將編碼DNA-AD的基因和cDNA文庫(kù)的基因構(gòu)建在AD-LIBRARY表達(dá)載體上，同時(shí)將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，這種改造后的酵母細(xì)胞既不能產(chǎn)生GAL4，也不能合成LEU、TRP、HIS和ADE等成分，當(dāng)將這種酵母培養(yǎng)在缺乏上述四種營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基上時(shí)酵母無法生長(zhǎng)。然而如果上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時(shí)，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報(bào)告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，從而通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落。將陽性反應(yīng)的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來，從而對(duì)載體中插入的文庫(kù)基因進(jìn)行測(cè)序和分析，以便確定誘餌蛋白和靶蛋白是否存在相互作用。

最初該系統(tǒng)主要用于研究核蛋白的功能，后來經(jīng)過改造，引入了分裂泛素技術(shù)，該技術(shù)是基于分離的泛素(split-ubiquitin)介導(dǎo)的膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)，它提供了不同于常規(guī)酵母雙雜交系統(tǒng)的蛋白體內(nèi)分析方法，使得分析膜蛋白間的互作成為現(xiàn)實(shí)。它的主要特點(diǎn)是可以進(jìn)行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白間的互作研究。它既可以用于表達(dá)文庫(kù)的篩選，也可以應(yīng)用于兩個(gè)已知蛋白(其中一個(gè)屬于膜蛋白)間互作關(guān)系的驗(yàn)證。已有的泛素分裂建庫(kù)方案在連接接頭時(shí)只提供一種讀碼框序列，cDNA序列連接進(jìn)載體時(shí)可能會(huì)存在多種閱讀框，因此可能會(huì)造成cDNA的閱讀框錯(cuò)誤從而造成假陰性率的提高。

因此，降低膜體系表達(dá)文庫(kù)假陰性率是建庫(kù)中亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述技術(shù)問題，本發(fā)明人在進(jìn)行了大量的深入研究之后，提供了一種用于降低膜體系表達(dá)文庫(kù)假陰性率的建庫(kù)方案。方案如下：增加反轉(zhuǎn)錄時(shí)所使用的總RNA的量并分離mRNA用于反轉(zhuǎn)錄，增加建庫(kù)接頭的種類。

優(yōu)選的，所述用于降低膜系統(tǒng)表達(dá)文庫(kù)序列冗余度并提高建庫(kù)效率的建庫(kù)方案，包括如下具體步驟：

(1)總RNA分離mRNA；

(2)mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA及cDNA的二鏈合成；

(3)對(duì)所得cDNA加接頭；

(4)將連接好接頭的cDNA進(jìn)行分級(jí)分離；

(5)與pDONR222進(jìn)行BP重組；