[發明專利]降低表達文庫假陰性率的膜系統建庫方案在審
| 申請號： | 201810375612.7 | 申請日： | 2018-04-24 |
| 公開（公告）號： | CN110396726A | 公開（公告）日： | 2019-11-01 |
| 發明（設計）人： | 王樹偉;趙仕蘭;肖云平 | 申請（專利權）人： | 上海歐易生物醫學科技有限公司 |
| 主分類號： | C40B50/06 | 分類號： | C40B50/06 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 201114 上海市閔行*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 表達文庫 反轉錄 假陰性 建庫 膜體系 分離mRNA 膜系統 總RNA 文庫 | ||
1.用于降低膜體系表達文庫假陰性率的一種建庫方案，其特征在于，增加用于反轉錄的起始總RNA量并分離mRNA進行反轉錄；增加文庫接頭的種類。
2.如權利要求1所述的降低膜體系表達文庫假陰性率的一種建庫方案包含：
(1)總RNA分離mRNA；
(2)mRNA反轉錄成cDNA及cDNA的二鏈合成；
(3)對所得cDNA加接頭；
(4)將連接好接頭的cDNA進行分級分離；
(5)與pDONR222進行BP重組；
(6)對文庫進行質檢；
(7)合格文庫制備初級文庫質粒；
(8)次級文庫制備。
3.如權利要求2所述的降低膜體系表達文庫假陰性率的一種建庫方案，其特征在于(1)用于反轉錄的總RNA樣本量需要用100-500微克，采用Oligotex mRNA Midi Kit方法分離mRNA，使用分離好的mRNA進行后續反轉錄實驗。
4.如權利要求2所述的降低膜體系表達文庫假陰性率的一種建庫方案，其特征在于(2)取1-5微克步驟(1)中分離的mRNA，加入biotin-attB2-Oligo(dT)Primer 1微升，dNTP微升混勻，70℃保溫5分鐘，降溫到45℃孵育2分鐘，再用SuperScript III反轉錄酶45℃保溫20分鐘，再依次加入E.coli.DNA Ligase、E.coli.DNA Polymerase I、E.coli.RNaseH各2U-50U，16℃保溫2小時，后加入T4 DNA Polymerase1 10U，繼續16℃保溫5-10分鐘，保溫結束后，加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混勻，靜置1分鐘，14,000rpm，室溫離心5分鐘，小心將上清取入新的離心管中，加入1/10體積醋酸鈉及2.5倍體積無水乙醇混勻，-20℃放置2小時后取出最大轉速離心3分鐘。去上清后加入75％乙醇1毫升，短暫離心取上清，重復一次，室溫晾干，加DEPC水重新溶解cDNA。
5.如權利要求2所述的降低膜體系表達文庫假陰性率的一種建庫方案，其特征在于步驟(2)溶解的cDNA平均分成三份，分別連接不同的建庫接頭attB1 Adapter F1和R1、attB1Adapter F2和R2及attB1 Adapter F3和R3各1-4微克，加入T4連接酶1U 16℃連接16-24小時。
表1 文庫接頭及序列
引物名稱 引物序列(5’-3’) RFα-F TCGTCGGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGG RFα-R CCAACTTTTTTGTACAAAGTTGTCCCC RFβ-F TCGTCGGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGA RFβ-R TCCAACTTTTTTGTACAAAGTTGTCCCC RFγ-F TCGTCGGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGAA RFγ-R TTCCAACTTTTTTGTACAAAGTTGTCCCC
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