[發明專利]一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201810372149.0
• 申請日: 2018-04-24
• 公開（公告）號: CN109022613A
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發明（設計）人: 徐邦偉;王勇;葛好林
• 申請（專利權）人: 上海申亞動物保健品阜陽有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 王桂名

本發明公開了一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，包括PCR反應緩沖液1、引物探針混合液2、酶系3、陰性對照和陽性對照，所述的引物探針混合液2是由一對引物和一條特異性熒光探針組成，所述的引物序列包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，所述的熒光探針的序列包括SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。與現有技術相比：本發明提供的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重RT?PCR檢測試劑盒，較傳統的病毒分離、單RT?PCR和血清型分型方法快捷，可以一次性鑒定歐洲型和美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒中的任何一種，以便于對疫病情況及區域、環境做出及時快捷的檢測，以最短的時間做出正確的檢測結果。

技術領域

本發明涉及分子診斷技術領域，尤其涉及的是一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒及檢測方法。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征(Procine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)(又名豬藍耳病)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Procine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起的，以母豬繁殖障礙、早產、流產、死胎、木乃伊胎及仔豬呼吸綜合征為特征的高度接觸性傳染病。根據基因型不同，該病分為美洲型和歐洲型兩種。按臨床表現的不同，豬藍耳病可分為經典豬藍耳病和高致病性豬藍耳病。高致病性豬藍耳病以高度接觸性傳播、全身出血、肺部實變和母豬繁殖障礙為特征，仔豬、育肥豬和成年豬均可發病和死亡，其中仔豬發病率可達100％、死亡率可達50％以上，母豬流產率可達30％以上。在我國僅2006年高致病性豬藍耳病暴發就超過200萬頭豬死亡。當前PRRSV對養豬業的影響和危害仍然存在。目前，PRRSV對畜牧養殖業構成巨大威脅，是世界動物衛生組織(Office International desepizooties,OIE)法定報告的動物傳染病之一。

1996年召開的第十屆國際病毒學大會上，國際病毒分類委員會第八次報告將PRRSV歸屬到尼多病毒目(Nidovirales)動脈炎病毒科(Arteriviviridea)中。PRRSV基因組為不分節段的單股正鏈RNA，全長約15kb。PRRSV基因組含有10個開放閱讀框(Open readingframes,ORFs)5’端有帽子結構，3’端有UTR和Poly-A尾巴，10個ORFs分別命名為ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-7以及新確定的ORF5a。PRRSV目前只有一個血清型，依據PRRSV抗原不同，將病毒分為兩個基因型，即美洲型(NA-PRRSV)和歐洲型(EU-PRRSV)。

當前我國PRRSV流行形勢有如下特點：一是點狀散發為我國PRRSV主要的流行特點，大規模暴發流行的風險較低。目前我國豬場仍以高致病性PRRSV流行為主，由于養殖戶防控意識加強、診斷技術成熟和疫苗的科學使用，PRRSV疫情的發生漸趨平緩，以點狀散發為主。但免疫帶毒和環境帶毒的現象仍很普遍，一些中小型豬場和散養戶因缺乏必要的生物安全措施，導致疫情仍然時有發生。另外，由于豬群發病后處置不當，也會造成發病豬群的高死亡率。

目前，傳統的PRRSV檢測方法主要包括病毒的分離與鑒定、免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)、間接免疫熒光試驗(IFA)、間接酶聯免疫吸附試驗(間接ELISA)和反轉錄－聚合酶鏈反應試驗(RT-PCR)等，這些方法在病毐診斷與進出口檢驗檢疫中發揮了重要作用，但各自在敏感性、特異性或時效性等方面存在不足，不適于疾病的快速診斷，容易錯失疫病防制的最佳時機。

我國目前美洲型經典株PRRSV、變異株PRRSV、類NADC30株PRRSV、歐洲株PRRSV和疫苗株等多種毒株共存共存增加了臨床診斷的難度，PRRSV防控工作面臨前所未有的嚴峻挑戰。鑒于我國PRRSV流行毒株復雜多變的特點，為改進現有PRRSV通用熒光RT-PCR檢測方法，本發明根據Genbank上國內PRRSV主要流行毒株全基因序列，設計特異性探針與引物，經過探針引物篩選及優化，建立了新的PRRSV通用型熒光定量RT-PCR檢測方法。