[發明專利]一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201810372149.0
• 申請日: 2018-04-24
• 公開（公告）號: CN109022613A
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發明（設計）人: 徐邦偉;王勇;葛好林
• 申請（專利權）人: 上海申亞動物保健品阜陽有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 王桂名

1.一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，其特征在于：包括PCR反應緩沖液1、引物探針混合液2、酶系3、陰性對照和陽性對照，所述的引物探針混合液2是由一對引物和一條特異性熒光探針組成，所述的引物序列包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，所述的熒光探針的序列包括SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

2.根據權利要求1所述的一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，其特征在于：所述的引物序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4為：

SEQ ID NO:1：上游引物CCAAATAAYAACGGCARG

SEQ ID NO:2：下游引物TGAGCRATGATCTTRCCCA

SEQ ID NO:3：上游引物GCYTGCAATCGATCCAGAC

SEQ ID NO:4：下游引物GAAACYRACCTTCCCRCTG。

3.根據權利要求1所述的一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，其特征在于：所述的探針序列SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6為：

SEQ ID NO:5：CACAGYTGATTGACTGRCTGGCC

SEQ ID NO:6：AGCGAYGCAGTTCCYGCGCC。

4.根據權利要求1所述的一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，其特征在于：所述的序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的擴增序列和序列SEQID NO:5和SEQ ID NO:6的探針引物濃度均為10uM/ul，所述的擴增引物與探針引物配比為2:2:2:2:1:1。

5.根據權利要求1所述的一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒組分的配比如下：

6.一種采用1-5任一所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒對豬繁殖與呼吸綜合征病毒進行檢測，其特征在于：檢測方法如下：

(1)樣本采集與處理

口腔分泌物和咽拭子：將拭子深入口腔來回3-5次取分泌液，拭子一并放入標本采集管，管中為含抗生素的PBS緩沖液

血液：無菌注射器直接采取，4℃保存或送檢；

肌肉和臟器：無菌采取后，低溫保存或冷藏送檢；

尿液和糞便：采集后，低溫保存或冷藏送檢；

(2)樣本RNA的提取

本試劑盒不含提取試劑，排泄物和血液樣本推薦使用QIAGEN公司的QIAampMinEluteVirus Spin Kit(貨號：57704)、天根生化科技有限公司病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(貨號：DP315),組織樣本推薦使用QIAGEN公司的AllPrep DNA/RNA Mini Kit(貨號：80204)；

(3)PCR反應體系的配制：

在試劑配制室按照試劑盒說明書要求進行配制，PCR反應緩沖液1：16μl，酶系3：2μl、引物探針混合液2：2μl。將PCR反應液按20μl/管分裝至PCR反應管中，將裝有PCR反應液的反應管移至樣本處理區；

(4)加樣

用帶濾芯的吸嘴分別取已處理好的樣本、陰性對照、陽性對照上清各5μl分別加到裝有反應體系的PCR反應管中。蓋上管蓋，離心數秒后移至擴增檢測區；

(5)擴增：將PCR反應管放入熒光PCR擴增儀中進行擴增檢測。

7.根據權利要求6所述的一種檢測方法，其特征在于：所述的步驟(5)中，循環參數設定如下：(AB：ABI 7500FAST，Anlong：Pro Eco48，SLAN-96)：