[發明專利]一種殼聚糖酶及其在殼寡糖制備中的應用

有效

• 申請號: 201810370251.7
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108330119B
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 毛相朝;郭娜;孫建安;薛長湖
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12P19/26;C12P19/14;C12P19/12
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

本發明提供一種殼聚糖酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。此酶具有良好的熱穩定性，最適反應溫度和pH分別為50℃、8.0，比酶活達330U/mg。該殼聚糖酶屬內切、外切混合型，其最小能降解的底物是殼二糖，并且能將殼聚糖水解成葡萄糖胺、殼二糖。有望將本發明殼聚糖酶用于殼寡糖的生產，具有實際應用價值。

技術領域

本發明屬于功能基因克隆表達技術領域，具體涉及一種殼聚糖酶及其在殼寡糖制備中的應用。

背景技術

殼寡糖是殼聚糖經水解后聚合度小于20，分子量小于3900的寡糖，是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GLcNAc)和D-氨基葡萄糖(GLcN)通過β-l,4-糖苷鍵連接而成。由于更低的分子量、更好的溶解性使得殼寡糖相較殼聚糖有著更為廣泛的應用。此外，殼寡糖還具備抗腫瘤、降血壓、增強免疫力等獨特的藥理功能活性，Jonge等人報道殼寡糖具有抑制植物病原菌的生長，誘導高等植物體內產生相關抗體等功能；Park等人發現殼寡糖對動物腫瘤細胞也有抑制效果，這使得殼寡糖在醫藥、保健品、食品、養殖等領域有了更大的應用價值。

殼聚糖能被多類酶水解。包括非專一性酶類：脂肪酶、蛋白酶、碳水化合物分解酶等，能將殼聚糖水解成聚合度低的殼寡糖。但是非專一性酶類水解到一定程度時，加大酶量也難以提高水解程度，而且水解產物較復雜、難以分離。

而使用殼聚糖酶(EC：3.2.1.132)水解殼聚糖來制備寡糖的方法具有反應條件溫和、反應過程容易控制等優點，且產物純度較高，利用基因工程構建高產殼聚糖酶的工程菌是工業化制備殼寡糖的有效途徑。

發明內容

本發明目的在于克服了傳統化學法水解殼聚糖的特異性低、設備要求高、污染環境、產品質量差等優點現有技術中的不足，提供了一種殼聚糖酶及其在殼寡糖制備中的應用，使用該殼聚糖酶降解大分子量的殼聚糖而制備小分子量的殼寡糖。

本發明所提供的殼聚糖酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1；

用于編碼本發明的殼聚糖酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO:2；

本發明還提供一種表達載體，用于表達上述的殼聚糖酶；

本發明的殼聚糖酶用于降解殼聚糖；

本發明提供一種制備殼二糖的方法，用本發明的殼聚糖酶制備殼二糖，最適反應pH和溫度分別為pH8.0、50℃，反應時間為2h。

本發明的殼聚糖酶能降解殼聚糖，該酶的酶活高，且有較好的溫度穩定性，此外，相較于已報道的殼聚糖酶，可高效的降解殼聚糖來制備殼二糖。

附圖說明

圖1：本發明的殼聚糖酶純化后的純酶SDS-PAGE電泳圖，M為標準蛋白Marker；1為粗酶蛋白；2為純化后的殼聚糖酶蛋白，

圖2：本發明的殼聚糖酶，溫度變化對相對酶活的影響，

圖3：本發明的殼聚糖酶，pH變化對相對酶活的影響，

圖4：本發明的殼聚糖酶，酶解產物的質譜圖。

具體實施方式

下面通過具體實例對本發明的方法做進一步的說明。

實施例1產殼聚糖酶基因片段的克隆

申請人通過分子生物學軟件分析白長鏈霉菌Streptomyces albolongus基因組，發現其中存在新型的殼聚糖酶基因，通過克隆該基因，從而促成了本發明。