[發(fā)明專利]一種重復(fù)片段介導(dǎo)的植物定點重組方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810368574.2
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN110396523B
• 公開（公告）日: 2023-06-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱健康;陸鈺明;田益夫;沈潤東;王木桂
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N9/22;A01H5/00;A01H6/46;C12N5/10
• 代理公司: 上海一平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31266
• 代理人: 王正君;徐迅

本發(fā)明提供了一種重復(fù)片段介導(dǎo)的植物定點重組方法，具體地，本發(fā)明提供一種具有特定重復(fù)序列的供體DNA，以及用于基因編輯的試劑組合。本發(fā)明通過采用具有特定結(jié)構(gòu)的供體DNA，借助定點切割核酸酶對目標(biāo)基因的特定位點進(jìn)行切割，高效的該供體DNA片段整合入切割位點。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種重復(fù)片段介導(dǎo)的植物定點重組方法。

背景技術(shù)

基因組編輯技術(shù)包括鋅指核酸技術(shù)(Zinc?finger?nuclease,ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)(transcription?activator-like(TAL)effector?nucleases,Talen)和CRISPR/Cas技術(shù)。這三種技術(shù)都可以在生物體基因組指定位點特異性的切割DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)，從而利用細(xì)胞自身具有的非同源末端連接或同源重組的特性，進(jìn)行定點編輯。ZFN和Talen技術(shù)采用特異性的蛋白來引導(dǎo)進(jìn)行基因組切割，其構(gòu)建相對較復(fù)雜，編輯效率很低。

通常認(rèn)為，在植物細(xì)胞內(nèi)的DNA斷裂修復(fù)機制以NHEJ為主導(dǎo)，HDR的概率相對非常低。因此，在進(jìn)行基因組編輯時，往往以NHEJ修復(fù)后的結(jié)果為主。雖然通過NHEJ途徑也可以進(jìn)行定點的敲入或者替換，但是其編輯結(jié)果表現(xiàn)為靶點位置的Indel。并且通過NHEJ在水稻中的重組效率很低，最高只有2％左右。目前，通過HDR實現(xiàn)精準(zhǔn)的敲入，在植物領(lǐng)域一直是一項難題。除非敲入或者替換序列為篩選標(biāo)簽，否則其實現(xiàn)效率非常低。到目前為止，在植物領(lǐng)域一直缺乏高效的基因組精準(zhǔn)敲入/替換的方法。

綜述所述，為了植物研究和育種的需要，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種高效的基因組精準(zhǔn)敲入/替換技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種高效的基因組精準(zhǔn)敲入/替換技術(shù)。

本發(fā)明第一方面提供了一種核酸構(gòu)建物，所述核酸構(gòu)建物具有從5’-3’的式I所示的結(jié)構(gòu)：

Y1-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Y2???(I)

其中，Y1為無或核苷酸序列；

Z1為第一DSB序列；

Z2為第一同源序列；

Z3為目的DNA序列；

Z4為第二同源序列；

Z5為第二DSB序列；

Y2為無或核苷酸序列；

并且，各“-”獨立地為鍵或核苷酸連接序列。

在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸連接序列包括長度為m個核苷酸的序列，其中，m為1-30，較佳地1-20，更佳地1-10(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。

在另一優(yōu)選例中，各“-”均為鍵。

在另一優(yōu)選例中，所述第一和第二DSB序列在gRNA的參與下被定位(識別)并切割。

在另一優(yōu)選例中，所述各DSB序列能夠被定點切割核酸酶識別并切割。

在另一優(yōu)選例中，所述各DSB序列各自獨立地：(a)自身含有切割位點，或(b)當(dāng)所述核酸構(gòu)建物通過NHEJ方式整合如靶位點后，形成的切割位點。

在另一優(yōu)選例中，所述第一DSB序列可在第一同源序列5’端的外側(cè)。

在另一優(yōu)選例中，所述第一DSB序列與第一同源序列部分重疊。

在另一優(yōu)選例中，所述第二DSB序列可在第二同源序列3’端的外側(cè)。

在另一優(yōu)選例中，所述第二DSB序列與第二同源序列部分重疊。