[發明專利]一種重復片段介導的植物定點重組方法

有效

• 申請號: 201810368574.2
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN110396523B
• 公開（公告）日: 2023-06-09
• 發明（設計）人: 朱健康;陸鈺明;田益夫;沈潤東;王木桂
• 申請（專利權）人: 中國科學院分子植物科學卓越創新中心
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N9/22;A01H5/00;A01H6/46;C12N5/10
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 王正君;徐迅

1.一種核酸構建物，其特征在于，所述核酸構建物具有從5’-3’的式I所示的結構：

Y1-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Y2????(I)

其中，Y1為無或核苷酸序列；

Z1為第一DSB序列；

Z2為第一同源序列；

Z3為目的DNA序列；

Z4為第二同源序列；

Z5為第二DSB序列；

Y2為無或核苷酸序列；

并且，各“-”獨立地為鍵或核苷酸連接序列，所述各DSB序列各自獨立地：(a)自身含有切割位點，或(b)含有當所述核酸構建物通過NHEJ方式整合入靶位點后形成的切割位點，所述第一DSB序列為10-50bp，所述第二DSB序列為10-50bp。

2.如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述第一和第二DSB序列在gRNA的參與下被定位并切割。

3.如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述各DSB序列能夠被定點切割核酸酶識別并切割。

4.如權利要求3所述的核酸構建物，其特征在于，所述定點切割核酸酶選自下組：ZFN、Talen和CRISPR/Cas9、或其組合。

5.如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述第一DSB序列、第二DSB序列能夠被選自下組的酶識別并切割：Cas9、Cpf1、C2C1、C2C2、C2C3等CRISPR相關酶。

6.?如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述第一DSB序列、第二DSB序列能夠被選自下組的酶識別并切割：Fok?I。

7.如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述第一DSB序列為15-30bp。

8.如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述第二DSB序列為15-30bp。

9.如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述第一同源序列為20bp-10kb。

10.如權利要求9所述的核酸構建物，其特征在于，所述第一同源序列為30bp-5kb。

11.如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述第二同源序列為20bp-10kb。

12.如權利要求11所述的核酸構建物，其特征在于，所述第二同源序列為30bp-5kb。

13.如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述目的DNA序列為待敲入和/或替換的序列。

14.如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述目的DNA序列為1bp-10kb。

15.如權利要求14所述的核酸構建物，其特征在于，所述目的DNA序列為5bp-5kb。

16.如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述核酸構建物為單鏈DNA序列或雙鏈DNA序列。

17.如權利要求16所述的核酸構建物，其特征在于，所述核酸構建物為雙鏈DNA序列。

18.如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述核酸構建物的一條和/或兩條DNA單鏈的5’末端進行磷酸化修飾。

19.如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述核酸構建物的5’和/或3’端的最末端的一個或多個堿基間的磷酸二酯鍵進行硫代修飾。