[發明專利]三元穿梭載體及利用其構建CLBV侵染性克隆的方法

在審

• 申請號: 201810367775.0
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108559759A
• 公開（公告）日: 2018-09-21
• 發明（設計）人: 宋震;崔甜甜;賓羽;晏建紅;李中安;周常勇
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/70;C12N15/66
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙) 50211
• 代理人: 鄒曉艷

本發明公開了一種三元穿梭載體pCY，其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。還公開了一種構建CLBV侵染性克隆的方法：(1)提取感染CLBV植株總RNA，反轉錄后采用pCY?CLBV1F、CLBV1R與CLBV2F、pCY?CLBV2R分別進行PCR擴增，得到覆蓋CLBV基因組全長的特異片段CLBV1、CLBV2；(2)用Stu I、Sma I酶切pCY；(3)TAR克隆：采用醋酸鋰法將CLBV1、CLBV2和線性化pCY共轉化酵母菌YPH501，通過同源重組獲得CLBV全長cDNA克隆pCY?CLBV；(4)pCY?CLBV質粒轉化農桿菌，接種柑桔或本生煙，鑒定獲得CLBV侵染性克隆。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種三元穿梭載體及利用其構建CLBV侵染性克隆的方法。

背景技術

柑桔葉斑駁病毒(Citrus leaf blotch virus，CLBV)屬乙型線形病毒科(Betaflexiviridae)柑桔病毒屬(Citrivirus)的代表成員，可以通過嫁接侵染大多數的柑桔品種，還可以通過種子傳播，具有一定的傳播流行風險。構建CLBV侵染性克隆將有助于了解其分子特性及致病機理，對于CLBV的流行防控也具有重要作用。另外，CLBV在多數柑桔品種上不會引起明顯的病毒感染癥狀，有望開發成為具有廣泛應用前景的病毒載體。CLBV基因組大小約為8.7kb，包含三個開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，分別編碼復制相關蛋白、運動蛋白及外殼蛋白，其中運動蛋白為沉默抑制子，5’-端有甲基化帽子結構，3’-端有poly A尾巴。

侵染性克隆不僅為病毒研究提供背景單一而可靠的遺傳材料，還可用于研究病毒的移動、復制及其致病機理，同時還為深入研究病毒與寄主互作機制、進行病毒載體化改造和應用奠定堅實的基礎。然而，病毒全長cDNA侵染性克隆的構建技術性較強，構建工作難度大。有研究表明，利用大腸桿菌構建較大基因組RNA病毒全長cDNA克隆時，由于其自身編碼的病毒蛋白可能會對宿主菌產生毒性作用，從而導致非特異性重組，出現不穩定現象。這成為病毒侵染性克隆構建面臨的最大困難和挑戰。病毒全長基因組克隆在E.coli中存在的不穩定現象的機制仍不清楚。通常利用以下幾個方法解決：將病毒序列分段克隆，侵染前再短暫的連接；或利用拷貝數目較低的載體；或是調控細菌生長的環境(如降低培養溫度等)來減少毒性；也有利用插入內含子到病毒全基因組序列中來避免產生具有毒性的蛋白。但這些方法均耗時耗力且成功率低。

酵母轉化伴隨的同源重組(TAR)是一種利用酵母高效同源重組系統來實現多個相互存在同源序列的DNA片段組裝方法。Youssef等(Youssef F,Marais A,Faure C,GentitP,Candresse T.Strategies to facilitate the development of uncloned or clonedinfectious full-length viral cDNAs:Apple chlorotic leaf spot virus as a casestudy.Virology Journal,2011,8(1):1-12)在構建蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chloroticleaf spot virus,ACLSV)時，從36個經限制性內切酶酶切正確的E.coli克隆中僅鑒定出1個有侵染性的克隆，表明ACLSV克隆在E.coli細胞存在著不穩定性，但經酵母TAR技術獲重組克隆后，直接通過農桿菌介導接種獲得了穩定的ACLSV的侵染性克隆。庹德財等(庹德財,沈文濤,言普,黎小瑛,周鵬.一種E.coli-Free的酵母同源重組系統穩定快速構建PLDMV侵染性克隆的新方法.熱帶作物學報,2017,38(8):1492-1500)在構建番木瓜畸形花葉病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)時，發現PLDMV在大腸桿菌中也存在不穩定現象，而當在PLDMV的P3基因中插入內含子時，經酵母重組后轉化E.coli能獲得測序正確的穩定的侵染性克隆。由于CLBV基因組較大，采用傳統的酶切連接法構建其侵染性克隆，費時費力且成功率低。在前期的嘗試中，利用大腸桿菌作宿主很難獲得CLBV的侵染性克隆，猜測可能與前述不穩定性有關。