[發明專利]三元穿梭載體及利用其構建CLBV侵染性克隆的方法

在審

• 申請號: 201810367775.0
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108559759A
• 公開（公告）日: 2018-09-21
• 發明（設計）人: 宋震;崔甜甜;賓羽;晏建紅;李中安;周常勇
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/70;C12N15/66
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙) 50211
• 代理人: 鄒曉艷

1.一種三元穿梭載體pCY，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。

2.一種構建CLBV侵染性克隆的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取感染CLBV植株的總RNA，反轉錄后以cDNA作為模板，采用兩對特異引物pCY-CLBV1F、CLBV1R與CLBV2F、pCY-CLBV2R分別進行PCR擴增，得到覆蓋CLBV基因組全長的兩個特異片段CLBV1、CLBV2；所述引物pCY-CLBV1F、CLBV1R、CLBV2F、pCY-CLBV2R的序列分別如SEQ ID NO:3～6所示；

(2)采用限制性內切酶Stu I、Sma I酶切如SEQ ID NO:17所示的三元穿梭載體pCY，得到pCY線性化的載體；

(3)TAR克隆：采用醋酸鋰轉化法將CLBV1、CLBV2和線性化三元穿梭載體pCY共轉化酵母菌YPH501，通過同源重組獲得CLBV基因組全長cDNA克隆pCY-CLBV；

(4)侵染性克隆鑒定：將pCY-CLBV質粒通過電擊轉化農桿菌C58C1，接種柑桔或本生煙，鑒定獲得CLBV侵染性克隆。

3.如權利要求2所述的構建CLBV侵染性克隆的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的三元穿梭載體pCY的構建方法為：

A、采用限制性內切酶SacII單酶切雙元載體質粒DK1317-2，得到線性化的載體；

B、以GenepYES1LVector為模板，以SEQ ID NO:1～2所示PYES2117F、PYES2117R為引物進行PCR擴增，然后回收目的片段；

C、將線性化DK1317-2載體和步驟B得到的回收片段進行重組融合，轉化大腸桿菌JM109，挑選陽性克隆，即得。