[發明專利]柑桔衰退病毒侵染性克隆的構建及接種方法

在審

• 申請號: 201810367772.7
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108531502A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 宋震;崔甜甜;賓羽;晏建紅;李中安;周常勇
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/82;C12N15/40;A01G7/06;C12R1/94
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙) 50211
• 代理人: 鄒曉艷

本發明公開了一種柑桔衰退病毒侵染性克隆的構建方法，步驟：(1)三個覆蓋CTV基因組全長特異片段CTV1、CTV2、CTV3的長鏈RT?PCR擴增；(2)三元穿梭載體pCY線性化；(3)TAR克隆：采用醋酸鋰轉化法將CTV1、CTV2、CTV3回收片段和線性化的三元穿梭載體pCY共轉化酵母菌YPH501；(4)轉化農桿菌；(5)農桿菌介導接種，從而鑒定獲得CTV侵染性克隆。還公開了侵染性克隆的接種方法：(1)播種：柑桔種子剝去外種皮播于培養基，暗培養；2)離心收集攜帶CTV侵染性克隆與Hc?Pro或P19表達質粒的農桿菌細胞，用接種緩沖液懸浮；(3)真空浸潤；(4)暗培養。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種柑桔衰退病毒侵染性克隆的構建及接種方法。

背景技術

柑桔衰退病毒(Citrus tristezavirus,CTV)是對世界柑桔生產具有嚴重危害的一種病原物。目前世界柑桔產量第二的巴西，曾一度因CTV為害而使其柑桔業瀕臨崩潰。迄今為止，CTV毀滅的柑桔樹達1億株以上，并且依然威脅著世界上以酸橙為砧木的柑桔和對CTV莖陷點型株系敏感的葡萄柚、柚和某些甜橙等品種(系)的生產。在我國，CTV分布較為普遍，初步鑒定表明株系分布亦很廣泛。但由于我國寬皮柑桔和甜橙生產上常用的砧木枳、酸桔、紅桔、紅黎檬、枸頭橙等多抗病或耐病而未造成嚴重為害。個別地區如云南賓川、建水等由于使用了感病的香櫞作砧木而導致柑桔植株大量死亡。CTV能夠侵染柑桔屬絕大多數種、栽培種和雜交種，還可侵染柑桔屬一些近緣屬植物。CTV可以通過包含韌皮部的組織嫁接傳播，在田間由桔蚜、棉蚜、桔二叉蚜和繡線菊蚜等蚜蟲以非循環半持久方式進行傳播。此外，CTV還可以通過菟絲子傳播。在人工接種條件下CTV可侵染本生煙。

CTV是甲型長線形病毒科，長線形病毒屬的一種正義單鏈單分體RNA病毒，是目前已知最大的植物病毒(Karasev et al.，1995)。其基因組為19226-19296nt的正義單鏈RNA，包裝于2000×11nm的螺旋對稱的線形病毒粒體當中，螺距3.5-3.7nm，每圈螺旋由8.5-10個外殼蛋白亞基構成。對T385序列分析表明，CTV基因組包含12個開放讀碼框(ORF1a、ORF1b、ORF2-ORF11)以及5’非轉譯區(5’UTR)、3’非轉譯區(3’UTR)。

侵染性克隆不僅為病毒研究提供背景單一而可靠的遺傳材料，還可用于研究病毒的移動、復制及其致病機理，同時還為深入研究病毒與寄主互作機制、進行病毒載體化改造和應用奠定堅實的基礎。然而，病毒全長cDNA侵染性克隆的構建技術性較強，構建工作難度大。由于CTV是最大的植物病毒，目前為止，僅有一個T36型CTV分離株獲得了侵染性克隆，該克隆采用傳統的酶切連接法構建，費時費力且成功率極低。同時，該克隆必須首先接種本生煙，2個月左右后提取病毒粒子才能夠接種和侵染柑桔，侵染周期長，侵染率較低，也限制了該克隆的應用。此外，有研究表明，利用大腸桿菌構建較大基因組RNA病毒全長cDNA克隆時，由于其自身編碼的病毒蛋白可能會對宿主菌產生毒性作用，從而導致非特異性重組，出現不穩定現象。這成為病毒侵染性克隆構建面臨的最大困難和挑戰。病毒全長基因組克隆在E.coli中存在的不穩定現象的機制仍不清楚。通常利用以下幾個方法解決：將病毒序列分段克隆，侵染前再短暫的連接；或利用拷貝數目較低的載體；或是調控細菌生長的環境(如降低培養溫度等)來減少毒性；也有利用插入內含子到病毒全基因組序列中來避免產生具有毒性的蛋白。但這些方法均耗時耗力且成功率低。在前期的嘗試中，利用大腸桿菌作宿主絕大多數CTV分離株都未能獲得侵染性克隆，猜測可能與前述不穩定性有關。