[發明專利]柑桔衰退病毒侵染性克隆的構建及接種方法

在審

• 申請號: 201810367772.7
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108531502A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 宋震;崔甜甜;賓羽;晏建紅;李中安;周常勇
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/82;C12N15/40;A01G7/06;C12R1/94
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙) 50211
• 代理人: 鄒曉艷

1.一種柑桔衰退病毒侵染性克隆的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)CTV基因組全長cDNA的長鏈RT-PCR擴增：提取感染CTV的植株總RNA，合成其基因組全長cDNA第一鏈，進而使用三對特異引物CTV1F、CTV1R，CTV2F、CTV2R與CTV3F、CTV3R分別進行PCR擴增，得到覆蓋CTV基因組全長的三個特異片段CTV1、CTV2、CTV3；所述引物CTV1F、CTV1R、CTV2F、CTV2R與CTV3F、CTV3R的序列分別如SEQ ID NO:3～8所示；

(2)三元穿梭載體pCY線性化：采用限制性內切酶Stu I、Sma I酶切如SEQ ID NO:17所示的三元穿梭載體pCY，得到pCY線性化的載體；

(3)TAR克隆：采用醋酸鋰轉化法將CTV1、CTV2、CTV3回收片段和線性化的三元穿梭載體pCY共轉化酵母菌YPH501，在酵母細胞內通過同源重組完成CTV基因組全長cDNA克隆的構建；

(4)轉化農桿菌：提取步驟(3)所獲酵母重組質粒，通過電擊轉入C58C1或GV3101農桿菌感受態細胞；

(5)農桿菌介導接種：接種柑桔或本生煙幼苗，從而鑒定獲得CTV侵染性克隆。

2.如權利要求1所述的柑桔衰退病毒侵染性克隆的構建方法，其特征在于，步驟(2)中所述的三元穿梭載體pCY的構建方法為：

A、采用限制性內切酶Sac II單酶切雙元表達載體質粒DK1317-2，得到線性化的載體；

B、以pYES1L Vector為模板，如SEQ ID NO:1～2所示的PYES2117F、PYES2117R為引物擴增，然后回收目的片段；

C、將線性化DK1317-2載體和步驟B得到的回收片段進行重組構建，轉化大腸桿菌JM109，挑選陽性克隆，即得。

3.如權利要求1所述的柑桔衰退病毒侵染性克隆的構建方法，其特征在于，所述步驟(5)農桿菌介導接種的方法為真空浸潤法接種，或者通過農桿菌注射接種4-6葉期的本生煙后再提取CTV病毒粒子接種柑桔。

4.一種柑桔衰退病毒侵染性克隆的接種方法，其特征在于，采用農桿菌介導的真空浸潤法，具體包括如下步驟：

(1)播種：柑桔種子剝去外種皮，播于培養基上暗培養5-10天；

(2)CTV接種緩沖液準備：分別離心收集攜帶CTV侵染性克隆與Hc-Pro或P19表達質粒的農桿菌細胞，用接種緩沖液懸浮，使其OD₆₀₀分別為0.8～1.2和0.2～0.5；

(3)真空浸潤：將步驟(1)所獲幼苗浸入步驟(2)的緩沖液，在真空下保持20～40秒并迅速釋放；

(4)暗培養：接種后置于培養箱暗培養5～7天，轉入自然條件下培養。

5.如權利要求4所述的柑桔衰退病毒侵染性克隆的接種方法，其特征在于，所述步驟(2)中攜帶CTV侵染性克隆質粒的農桿菌細胞是通過權利要求1中步驟(1)至(4)得到的。

6.如權利要求4所述的柑桔衰退病毒侵染性克隆的接種方法，其特征在于，所述步驟(2)中用于懸浮農桿菌細胞的緩沖液中包含10mmol·L^-1MgCl₂，10mmol·L^-1MES，200μmol·L^-1AS。