[發明專利]一種金銀忍冬莖尖超低溫保存方法

有效

• 申請號: 201810367569.X
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108371179B
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 宋紅;田曉璇;李萍;李享
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: A01N3/00
• 分類號: A01N3/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種金銀忍冬莖尖超低溫保存方法，依次包括：金銀忍冬莖尖的剝離和預處理、裝載、脫水、液氮保存、解凍以及恢復培養的方法。本發明可保持其優良特性、操作方便、可行性強，利于保存優良種質資源。用莖尖經超低溫保存后其遺傳物質相對穩定，大部分可直接形成完整的小植株，故在金銀忍冬種質資源保存以及其他相關研究方面上具有重要的使用價值。

技術領域

本發明涉及一種莖尖長期保存方法，具體是一種金銀忍冬莖尖超低溫保存方法。

背景技術

金銀忍冬，別名金銀木，屬忍冬科忍冬屬，是我國良好的觀賞灌木之一。樹皮常具有不規則縱列，顏色呈灰白色至灰褐色。金銀忍冬花腋生，每2朵小花生于一枚總花柄上，單花為唇形花冠，花朵開放時期為白色，開放后逐漸變為淡黃色，層層開花，金銀相映。果實為紅色漿果，常簇生于長枝上，秋天觀賞，紅果累累。金銀忍冬花朵清雅芳香，是優良的蜜源樹種；金銀忍冬適應環境能力強，喜光、耐半蔭，耐寒且耐旱，管理簡單；金銀忍冬的果、葉和花中含有豐富的脂肪、類胡蘿卜素和維生素C；金銀忍冬果實多糖含量高且果的多糖是一種天然抗氧化劑，在醫療、食品及化妝品產業均有開發利用價值；金銀忍冬全株都有藥用價值,可以增強免疫力，具有清熱解毒的功效，其中葉的浸汁可殺棉蚜蟲等,花則可作金銀花用。因此，金銀忍冬在觀賞、工商業及藥用方面具有較高的應用價值。由于金銀忍冬莖尖的超低溫保存可以維持金銀忍冬的遺傳穩定性，為了避免由于外界氣候的變化以及人類的過度開發而導致的金銀忍冬種質資源的滅絕，所以可用莖尖進行超低溫保存，從而保持其優良特性。

超低溫保存是指通過一定的保存處理，使保存材料可以實現在－196℃液氮低溫中安全長期保存，取出時并采取一定的解凍方法令其恢復常溫并使材料可以正常恢復生長的一整套生物技術。在這一變化過程中，保存材料細胞內的化學成分沒有發生實質性的變化，僅在物理結構方面發生變化，且這種變化是可逆的，因此不會有效損傷到細胞的生物學活性，所以在植物材料解凍后仍然能夠保持普通細胞的正常活性及遺傳穩定性，從而有效、安全地長期保存植物種質資源。由于莖尖的分生組織細胞的分化程度較小，在超低溫保存后的再生過程中遺傳物質相對于其他材料穩定，大部分可直接形成完整的小植株，可大大降低植物變異的可能性，特別是針對一些通過營養繁殖的植物種類和一些易產生變異的植物類型，莖尖更是最理想的超低溫保存材料。

用莖尖進行超低溫保存，其優點是：遺傳穩定性強、可保持其優良特性、操作方便、可行性強，利于種質資源的保存。

目前，金銀忍冬莖尖超低溫保存還尚未見報道。所以研發一種適合于金銀忍冬莖尖超低溫保存的方法是非常有必要的。

發明內容

本發明的目的是通過以下技術方案來實現：

本發明涉及一種金銀忍冬莖尖超低溫保存的方法，依次包括：金銀忍冬莖尖的剝離和預培養、裝載、脫水、液氮保存、解凍以及恢復培養的方法。

優選地，所述的剝離和預培養是指：將剝離后的莖尖放入預培養液中處理，預培養液中蔗糖最適濃度為0.3mol/L的MS溶液，于4℃條件下預培養3d。

優選地，所述的裝載具體是指：將預培養后的離體莖尖轉接于LS裝載液中，于室溫25℃下裝載10～50min；所述的裝載液的組成為：2M甘油+0.4mol/L蔗糖+MS的溶液。

優選地，所述的脫水具體是指：將裝載后的莖尖放入PVS2保護液于0℃條件下脫水20～100min；所述的PVS2保護液的組成為：30％甘油+15％乙二醇+15％二甲基亞砜+0.4mol/L蔗糖+MS的溶液。

優選地，所述的液氮保存是指：將PVS2保護液處理后的莖尖更換新鮮的PVS2保護液，然后迅速投入液氮中，保存24h。

優選地，所述的解凍是指：將液氮保存后的冷凍管取出進行化凍，所述的化凍方式為：用40℃水浴解凍莖尖70s。