[發(fā)明專利]用于在鴨疫里默氏桿菌基因組插入外源基因的載體及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810367557.7
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108841850A
• 公開（公告）日: 2018-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉馬峰;黃月;劉珈均;程安春;汪銘書;朱德康
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/90
• 代理公司: 成都玖和知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51238
• 代理人: 胡琳梅

本發(fā)明涉及一種用于在鴨疫里默氏桿菌基因組插入外源基因的載體及方法，所述載體由質(zhì)粒pMM47.A用PstI限制性內(nèi)切酶切去復(fù)制起始位點連接得到質(zhì)粒pMM47.B，再將以含高表達啟動子的pheS突變基因克隆至質(zhì)粒pMM47.B的SalI和XbaI酶切位點處，獲得自殺載體pOES，然后在自殺載體pOES下游連入內(nèi)部含有外源基因編碼序列的重組基因序列，該載體能夠簡便的將外源基因插入鴨疫里默氏桿菌基因組上，為研究細菌的蛋白定位提供了技術(shù)參考。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及用于在鴨疫里默氏桿菌基因組插入外源基因的載體，還涉及利用該載體在鴨疫里默氏桿菌基因組中插入外源基因的方法。

背景技術(shù)

在細菌學(xué)研究中，功能蛋白的定位是研究蛋白功能的重要組成部分。目前所使用的方法為，通過基因工程的方法將目的蛋白的基因在大腸桿菌異源表達、純化并通過免疫動物來制備抗目的蛋白的多克隆抗體。然后，提取細菌的各組成成份，如外膜蛋白、胞漿蛋白等，通過免疫印跡的方法來檢測目的蛋白的定位。此種方法費時費力，且涉及動物試驗不利于動物福利的提高。因此，急需一種既能提高試驗的效率又能提高動物福利的方法來替代這種傳統(tǒng)的方法。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于在鴨疫里默氏桿菌基因組插入外源基因的載體；本發(fā)明的目的之二在于提供利用所述載體在鴨疫里默氏桿菌基因組插入外源基因的方法。

為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1.用于在鴨疫里默氏桿菌基因組插入外源基因的載體，所述載體由質(zhì)粒pMM47.A用PstI 限制性內(nèi)切酶切去復(fù)制起始位點連接得到質(zhì)粒pMM47.B，再將以含高表達啟動子的pheS突變基因克隆至質(zhì)粒pMM47.B的SalI和XbaI酶切位點處，獲得自殺載體pOES，然后在自殺載體pOES下游連入內(nèi)部含有外源基因編碼序列的重組基因序列。

優(yōu)選的，所述含高表達啟動子的pheS突變基因由以下方法制得：以質(zhì)粒pLMF03::pheS* 作為模板，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示序列為引物進行PCR擴增；所述質(zhì)粒pLMF03::pheS*由如SEQ ID NO.5所示序列連入穿梭質(zhì)粒pLMF03而得。

優(yōu)選的，所述外源基因為標簽蛋白血凝素肽基因。

優(yōu)選的，所述含有外源基因編碼序列的重組基因序列的核苷酸如核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

2.利用所述載體在鴨疫里默氏桿菌基因組插入外源基因的方法，包括如下步驟：將所述載體轉(zhuǎn)化供體菌S17.1，然后通過接合轉(zhuǎn)移的方法將載體轉(zhuǎn)移至鴨疫里默氏桿菌野生株RA ATCC11845中，涂在含有頭孢西丁和卡那霉素的血平板上，篩選出第一次同源重組的陽性克隆，經(jīng)擴大培養(yǎng)后涂板在含有p-cl-Phe的GCB平板上使其進行第二次同源重組，篩選陽性克隆，即外源基因插入鴨疫里默氏桿菌基因組。

優(yōu)選的，所述血平板上，頭孢西丁和卡那霉素的濃度分別為1μg/ml和20μg/ml。

優(yōu)選的，所述擴大培養(yǎng)條件如下：將第一次同源重組的菌株在TSB培養(yǎng)基中37℃、180 rpm搖菌過夜。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明用于在鴨疫里默氏桿菌基因組插入外源基因的載體，該載體中含有外源基因，如序列標簽，可以簡便高效的方法進行基因組上插入外源基因，如標簽，后續(xù)可以用于鴨疫里默氏桿菌的蛋白定位研究。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的技術(shù)優(yōu)勢和積極效果：

1.提供了一種在鴨疫里默氏桿菌基因組上插入標簽的方法。

2.具有生物普遍性，為研究其它細菌的蛋白定位提供了技術(shù)參考。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進行說明：