[發明專利]用于在鴨疫里默氏桿菌基因組插入外源基因的載體及方法

在審

• 申請號: 201810367557.7
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108841850A
• 公開（公告）日: 2018-11-20
• 發明（設計）人: 劉馬峰;黃月;劉珈均;程安春;汪銘書;朱德康
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/90
• 代理公司: 成都玖和知識產權代理事務所(普通合伙) 51238
• 代理人: 胡琳梅

1.用于在鴨疫里默氏桿菌基因組插入外源基因的載體，其特征在于：所述載體由質粒pMM47.A用PstI限制性內切酶切去復制起始位點連接得到質粒pMM47.B，再將以含高表達啟動子的pheS突變基因克隆至質粒pMM47.B的SalI和XbaI酶切位點處，獲得自殺載體pOES，然后在自殺載體pOES下游連入內部含有外源基因編碼序列的重組基因序列。

2.根據權利要求1所述用于在鴨疫里默氏桿菌基因組插入外源基因的載體，其特征在于：所述含高表達啟動子的pheS突變基因由以下方法制得：以質粒pLMF03::pheS*作為模板，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示序列為引物進行PCR擴增；所述質粒pLMF03::pheS*由如SEQ ID NO.5所示序列連入穿梭質粒pLMF03而得。

3.根據權利要求1所述用于在鴨疫里默氏桿菌基因組插入外源基因的載體，其特征在于：所述外源基因為標簽蛋白血凝素肽基因。

4.根據權利要求1所述用于在鴨疫里默氏桿菌基因組插入外源基因的載體，其特征在于：所述含有外源基因編碼序列的重組基因序列的核苷酸如核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

5.利用權利要求1～4任一項所述載體在鴨疫里默氏桿菌基因組插入外源基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：將所述載體轉化供體菌S17.1，然后通過接合轉移的方法將載體轉移至鴨疫里默氏桿菌野生株RA ATCC11845中，涂在含有頭孢西丁和卡那霉素的血平板上，篩選出第一次同源重組的陽性克隆，經擴大培養后涂板在含有p-cl-Phe的GCB平板上使其進行第二次同源重組，篩選陽性克隆，即外源基因插入鴨疫里默氏桿菌基因組。

6.根據權利要求5所述載體在鴨疫里默氏桿菌基因組插入外源基因的方法，其特征在于：所述血平板上頭孢西丁和卡那霉素的濃度分別為1μg/ml和20μg/ml。

7.根據權利要求5所述載體在鴨疫里默氏桿菌基因組插入外源基因的方法，其特征在于：所述擴大培養條件如下：將第一次同源重組的菌株在TSB培養基中37℃、180rpm搖菌過夜。