[發(fā)明專利]用于鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的載體及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810367550.5
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108841849A
• 公開（公告）日: 2018-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉馬峰;黃月;劉珈均;程安春;汪銘書;朱德康
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/90
• 代理公司: 成都玖和知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 51238
• 代理人: 胡琳梅

本發(fā)明涉及一種用于鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的載體及方法，所述載體由cfx基因克隆至質(zhì)粒pBAD24酶切位點KpnI和XbaI獲得質(zhì)粒pBAD24::cfx，然后再將EXpheS*連入質(zhì)粒pBAD24::cfx的XbaI和SalI酶切位點處，獲得基因突變的模板載體，命名為pBAD24::cfx+EXpheS*；然后將突變基因上游序列和突變基因下游序列分別連入pBAD24::cfx+EXpheS*載體的cfx基因上游和EXpheS*下游，即獲得用于鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的載體；該載體能夠簡便高效的進行鴨疫里默氏桿菌基因組點突變，進而可以用于鴨疫里默氏桿菌的基因功能的研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及用于鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的載體，還涉及利用該載體對鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的方法。

背景技術(shù)

鴨疫里默氏桿菌是一種重要的禽類致病細菌。目前由于缺乏相應的基因編輯工具，所以對鴨疫里默氏桿菌的基因功能及致病機制研究較少且不深入。基因編輯技術(shù)對研究基因的功能至關(guān)重要。目前可用于鴨疫里默氏桿菌的基因編輯技術(shù)主要為基因的缺失及回補，然而如果需要對功能基因的關(guān)鍵區(qū)域或關(guān)鍵氨基酸進行研究，則需要對功能基因進行點突變。其中一種方法是通過重疊PCR的方法產(chǎn)生點突變，再將這種含有突變位點的基因克隆到穿梭質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入基因缺失株進行研究。然而這種方法并不能完全反映基因點突變后在基因組本身的情況。另外，穿梭質(zhì)粒在復制過程中存在丟失的風險。為克服以上的缺陷，急需一種用于鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的方法。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的載體；本發(fā)明的目的之二在于提供利用所述載體在鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的方法。

為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1.用于鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的載體，所述載體由cfx基因克隆至質(zhì)粒pBAD24酶切位點KpnI和XbaI獲得質(zhì)粒pBAD24::cfx，然后再將EXpheS*連入質(zhì)粒pBAD24::cfx的XbaI和SalI酶切位點處，獲得基因突變的模板載體，命名為pBAD24::cfx+EXpheS*；然后將突變基因上游序列和突變基因下游序列分別連入pBAD24::cfx+EXpheS*載體的cfx基因上游和EXpheS*下游，即獲得用于鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的載體。

優(yōu)選的，所述EXpheS*由以pLMF03::pheS*質(zhì)粒作為模板，SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9所示序列為引物進行PCR擴增，即獲得EXpheS*；所述pLMF03::pheS*質(zhì)粒由如SEQ IDNO.5所示序列連入穿梭質(zhì)粒pLMF03而得。

優(yōu)選的，所述cfx基因由以下方法制得：以質(zhì)粒pLMF03作為模板，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示序列為引物進行PCR擴增，獲得cfx基因。

優(yōu)選的，所述突變基因上游序列由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示序列為引物，鴨疫里默氏桿菌基因組DNA為模板進行PCR擴增而得；所述突變基因下游序列由SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.13所示序列為引物，鴨疫里默氏桿菌基因組DNA為模板進行PCR擴增而得。

2.利用所述載體在鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的方法，將載體中含有突變基因上游序列、cfx基因、EXpheS*和突變基因下游序列的序列擴增出來，通過自然轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入鴨疫里默氏桿菌野生株RA ATCC中，將其涂在含有1μg/ml頭孢西丁cfx的GCB平板上，篩選出第一次同源重組的陽性克隆，命名為RA ATCCΔRA0C_1912::cfx+EXpheS*，將含有突變基因點突變的序列通過自然轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入RA ATCCΔRA0C_1912::cfx+EXpheS*中，將其涂在含有13mM p-cl-Phe的GCB平板上，篩選出第二次同源重組的陽性克隆。