[發明專利]用于鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的載體及方法

在審

• 申請號: 201810367550.5
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108841849A
• 公開（公告）日: 2018-11-20
• 發明（設計）人: 劉馬峰;黃月;劉珈均;程安春;汪銘書;朱德康
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/90
• 代理公司: 成都玖和知識產權代理事務所(普通合伙) 51238
• 代理人: 胡琳梅

1.用于鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的載體，其特征在于：所述載體由cfx基因克隆至質粒pBAD24酶切位點KpnI和XbaI獲得質粒pBAD24::cfx，然后再將EXpheS*連入質粒pBAD24::cfx的XbaI和SalI酶切位點處，獲得基因突變的模板載體，命名為pBAD24::cfx+EXpheS*；然后將突變基因上游序列和突變基因下游序列分別連入pBAD24::cfx+EXpheS*載體的cfx基因上游和EXpheS*下游，即獲得用于鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的載體。

2.根據權利要求1所述用于鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的載體，其特征在于：所述EXpheS*由以pLMF03::pheS*質粒作為模板，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示序列為引物進行PCR擴增，即獲得EXpheS*；所述pLMF03::pheS*質粒由如SEQ ID NO.5所示序列連入穿梭質粒pLMF03而得。

3.根據權利要求1所述用于鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的載體，其特征在于：所述cfx基因由以下方法制得：以質粒pLMF03作為模板，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示序列為引物進行PCR擴增，獲得cfx基因。

4.根據權利要求1所述用于鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的載體，其特征在于：所述突變基因上游序列由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示序列為引物，鴨疫里默氏桿菌基因組DNA為模板進行PCR擴增而得；所述突變基因下游序列由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示序列為引物，鴨疫里默氏桿菌基因組DNA為模板進行PCR擴增而得。

5.利用權利要求1～4任一項所述載體在鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的方法，其特征在于：將載體中含有突變基因上游序列、cfx基因、EXpheS*和突變基因下游序列的序列擴增出來，通過自然轉化的方法轉入鴨疫里默氏桿菌野生株RA ATCC11845中，將其涂在含有1μg/ml頭孢西丁cfx的GCB平板上，篩選出第一次同源重組的陽性克隆，命名為RA ATCCΔRA0C_1912::cfx+EXpheS*，將含有突變基因點突變的序列通過自然轉化的方法轉入RAATCC ΔR A0C_1912::cfx+EXpheS*中，將其涂在含有13mM p-cl-Phe的GCB平板上，篩選出第二次同源重組的陽性克隆。

6.根據權利要求5所述載體在鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的方法，其特征在于：所述含有突變基因上游序列、cfx基因、EXpheS*和突變基因下游序列的序列由以所述載體為模板，SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.12所示序列為引物擴增獲得。

7.根據權利要求5所述載體在鴨疫里默氏桿菌基因組點突變的方法，其特征在于：含有突變基因點突變的序列由以下方法獲得：分別以SEQ ID NO.13與SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15與SEQ ID NO.16為引物，鴨疫里默氏桿菌基因組DNA為模板進行PCR擴增獲得產物后，然后以擴增產物為模板，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.16為引物進行融合PCR獲得點突變序列。