[發明專利]基于FRET效應探測細胞凋亡過程的方法

有效

• 申請號: 201810366318.X
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108732147B
• 公開（公告）日: 2021-01-19
• 發明（設計）人: 張寅;朱恒宇;吳琦;趙強;劉淑娟;黃維
• 申請（專利權）人: 南京郵電大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C07F15/00;C09K11/06
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 陳忠輝

本發明提供一種基于FRET效應來探測細胞凋亡過程的方法，其主要步驟是：制備具有長壽命的磷光銥配合物作為給體D，制備短壽命有機熒光小分子化合物作為受體A，D和A兩者之間存在FRET效應；通過生物正交反應，將給體D和受體A分別連接到能夠被僅存在于細胞凋亡過程中的caspase酶剪切的肽鏈的兩端，構成D?A型探針，所述D?A型探針可以在細胞外組裝構成然后植入到細胞內部，也可以直接在細胞內組裝；利用共聚焦成像或壽命成像技術，檢測D?A型探針當中給體D或受體A的壽命變化，從而判斷細胞的凋亡進程。本發明可應用于細胞凋亡各個階段，能夠分辨細胞凋亡的各個時期，在細胞成像、生物標記和傳感領域等方面具有非常重要的應用前景。

技術領域

本發明屬于有機光電材料技術領域，具體涉及一類基于FRET效應的可用于細胞凋亡檢測的D-A型探針，及其在細胞凋亡過程中的探測應用。

背景技術

細胞凋亡亦稱為細胞程序性死亡，是細胞在一系列內源性基因的調控下發生的自然或生理性死亡現象，它在引導胚胎的形成、維持正常細胞的平衡、調節生物體的生長發育和自然衰老等方面，扮演著非常重要的角色，其具體途徑以及凋亡過程中涉及的復雜細節，至今尚未完全了解。因此，探索不同的方法來研究細胞凋亡過程及其具體細節，其意義十分重大。

現有技術當中，對于凋亡細胞的檢測主要是應用凝膠電泳技術和流式細胞術，根據細胞凋亡時的分子變化進而判定細胞是否凋亡。盡管這些技術提供了有用的信息，但它們是基于凋亡終點的分析，不能直接并實時觀察凋亡過程。目前，對細胞凋亡過程的檢測，主要是利用熒光成像技術對凋亡細胞過程中的典型性特征進行檢測，如：凋亡早期細胞表面出現的磷脂酰絲氨酸(PS)和線粒體膜電位的變化，凋亡晚期出現染色質斷裂，等等。這類技術需要通過多種結果來判定細胞凋亡，無法通過單一的探針對細胞凋亡的各個階段進行檢測，存在著檢測假陽性的可能性。

另一方面，熒光成像技術雖然優點突出，但是其缺點也無法避免，比如：探針熒光(或磷光)的強度強烈依賴于濃度，受生物背景熒光干擾強，在短時間內易于光漂白，熒光探針的發射帶傾向于重疊，限制了多種探針的同時使用，等等。然而，熒光(或磷光)壽命是熒光物質的固有性質，與濃度、光漂白和激發強度無關，與熒光成像相比，熒光壽命成像技術具有熒光壽命區間范圍廣、分辨率高、受背景熒光干擾小、重疊范圍小、可同時使用等優點，已逐漸成為細胞生物學中有影響力的檢測手段。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于FRET效應來探測細胞凋亡過程的方法，旨在更有效、更直接地探測細胞凋亡過程。

本發明的技術解決方案是：基于FRET效應探測細胞凋亡過程的方法，包括以下步驟：

S1，制備具有長壽命的磷光銥配合物作為給體D：首先制備得到可以同疊氮發生生物正交反應的產物，然后將其與對硝基苯基氯甲酸酯連接，再與含有氨基的物質反應生成輔助配體，輔助配體再與銥二氯橋通過配位反應制備得到磷光銥配合物。

S2，制備有機熒光小分子化合物作為受體A，受體A的壽命比給體D短，兩者之間存在FRET效應；首先制備得到可以同降冰片烯發生生物正交反應的產物，然后通過縮合反應將其連接到含有羧基的短壽命的有機熒光小分子化合物上。

S3，通過生物正交反應，將給體D和受體A分別連接到肽鏈的兩端構成D-A型探針，所述肽鏈是能夠被僅存在于細胞凋亡過程中的caspase酶剪切的肽鏈，所述D-A型探針可以在細胞外組裝構成然后植入到細胞內部，也可以直接在細胞內組裝；

S4，利用共聚焦成像或壽命成像技術，檢測D-A型探針當中給體D的壽命變化，判斷細胞的凋亡進程；或檢測D-A型探針當中受體A的壽命變化，判斷細胞的凋亡進程。