[發明專利]基于FRET效應探測細胞凋亡過程的方法

有效

• 申請號: 201810366318.X
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108732147B
• 公開（公告）日: 2021-01-19
• 發明（設計）人: 張寅;朱恒宇;吳琦;趙強;劉淑娟;黃維
• 申請（專利權）人: 南京郵電大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C07F15/00;C09K11/06
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 陳忠輝

1.基于FRET效應探測細胞凋亡過程的方法，包括以下步驟：

S1，制備具有長壽命的磷光銥配合物作為給體D；

S2，制備有機熒光小分子化合物作為受體A，受體A的壽命比給體D短，兩者之間存在FRET效應；

S3，通過生物正交反應，將給體D和受體A分別連接到肽鏈的兩端構成D-A型探針，所述肽鏈是能夠被僅存在于細胞凋亡過程中的caspase酶剪切的肽鏈，所述D-A型探針在細胞外組裝構成然后植入到細胞內部，或者直接在細胞內組裝；

S4，利用共聚焦成像或壽命成像技術，檢測D-A型探針當中給體D的壽命變化，判斷細胞的凋亡進程；或檢測D-A型探針當中受體A的壽命變化，判斷細胞的凋亡進程。

2.根據權利要求1所述的基于FRET效應探測細胞凋亡過程的方法，其特征在于：步驟S1的方法是，首先制備得到可以同疊氮發生生物正交反應的產物，然后將其與對硝基苯基氯甲酸酯連接，再與含有氨基的物質反應生成輔助配體，輔助配體再與銥二氯橋通過配位反應制備得到磷光銥配合物。

3.根據權利要求2所述的基于FRET效應探測細胞凋亡過程的方法，其特征在于：步驟S1的方法是，以二苯并環庚酮為原料，在-78℃條件下同三甲基甲硅烷基重氮甲烷反應得到產物2；2被硼氫化鈉還原制得產物3；通過加成反應將液溴加到產物3中的雙鍵上得到產物4；產物4同LDA作用制得產物5；產物5可以同對硝基苯基氯甲酸酯發生取代反應制得產物6；用二氧化硒氧化4,4'-二甲基-2,2'-聯吡啶制得產物8；產物8同鹽酸羥氨反應制得產物9；產物9經過氨化反應制得產物10；產物10與產物6發生取代反應制得輔助配體11；輔助配體同苯喹啉二氯橋反應制得給體Ir-DIBO。

4.根據權利要求1所述的基于FRET效應探測細胞凋亡過程的方法，其特征在于：步驟S2的方法是，首先制備得到可以同降冰片烯發生生物正交反應的產物，然后通過縮合反應將其連接到含有羧基的短壽命的有機熒光小分子化合物上。

5.根據權利要求4所述的基于FRET效應探測細胞凋亡過程的方法，其特征在于：步驟S2的方法是，用二碳酸二叔丁酯保護對氰基芐胺上的氨基制得產物2；產物2同乙腈、Zn(OTf)2和一水合肼反應制得產物3；產物3在濃鹽酸的作用下脫去氨基保護基團制得氨基四嗪；氨基四嗪上的氨基同羅丹明B上的羧基發生縮合反應制得受體四嗪羅丹明即TR。

6.根據權利要求1所述的基于FRET效應探測細胞凋亡過程的方法，其特征在于：所述給體D具有如下結構式一或結構式二

其中，C^N配體為下列中的任一個：

7.根據權利要求1所述的基于FRET效應探測細胞凋亡過程的方法，其特征在于：所述受體A具有如下結構式

其中，A為以下任意一個含有羧基的有機熒光小分子化合物：

8.根據權利要求1所述的基于FRET效應探測細胞凋亡過程的方法，其特征在于：所述D-A型探針具有如下結構式

其中XXXX為連接肽鏈，選自WEHD、LEHD、DETD、DEVD、DEHD、VEHD、LETD、LEHD中的任意一個。