[發明專利]一種熱處理去除PCV2 VLPs中非VLPs蛋白的方法

有效

• 申請號: 201810364014.X
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108588154B
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 杜恩岐;李折折;石聿勇;肖何;張志剛
• 申請（專利權）人: 楊凌凱瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/01;C07K1/14;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/19
• 代理公司: 北京貴都專利代理事務所(普通合伙) 11649
• 代理人: 李新鋒

本發明公開了一種熱處理去除PCV2 VLPs樣品clear E.coli BL21(DE3)/pET28a?cap中非VLPs蛋白的方法。根據文獻及專利調研，用硫酸銨沉淀方法初步制備PCV2 VLPs粗樣品，對制備的PCV2 VLPs粗樣品進行熱處理，離心分離PCV2 VLPs粗樣品熱處理后的上清和沉淀，對處理前后PCV2 VLPs樣品進行SDS?PAGE檢測、瓊擴效價檢測，并電鏡觀察處理前后的VLPs。通過本方法處理，在不損失PCV2 VLPs（瓊擴效價不降低）的前提下去掉了PCV2 VLPs樣品中大部分雜蛋白及部分未形成VLPs的目的蛋白（即非VLPs蛋白）。

技術領域：

本發明屬于基因工程產品制備領域，具體涉及一種熱處理去除PCV2 VLPs中非VLPs蛋白的方法。

背景技術:

豬圓環病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（Postweaning muLtisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原，此外還與豬皮炎與腎病綜合征、仔豬先天性震顫、流產和滲出性皮炎等有關，這些疾病統稱為豬圓環病毒病。

目前，該病廣泛流行于世界各地，在我國豬群中流行較為嚴重，臨床上常與豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟和豬細小病毒等混合感染，繼發感染，給養豬業造成了巨大的損失。目前，疫苗接種是防控PCV2的有效手段，國內外研發的商品化PCV2疫苗已陸續獲得上市認可，主要包括全病毒滅活疫苗、重組病毒嵌合滅活疫苗和重組亞單位疫苗，這些疫苗的應用為PCV2感染的控制發揮了重要的作用。但強毒滅活不徹底或弱毒返祖可能導致免疫個體發病。尤其是那些容易產生遺傳變異或重組的致弱病毒，變異或返祖的風險更大。在特定條件下，免疫個體能感染同一種病毒的不同血清型或變異株，遺傳物質在宿主體內重新混合或者重組，最終產生新的病毒變異株。病毒樣顆粒（Virus-like particles,VLPs）疫苗代表了一類特殊的基因工程亞單位疫苗，它有著與病毒粒子相似的天然結構，且容易制備高純度和高效價的抗原。VLPs不攜帶病毒的任何DNA/RNA遺傳物質，克服了全病毒滅活疫苗和全病毒弱毒活疫苗可能出現的散毒、重組以及變異的潛在可能性。VLPs疫苗因其具有安全、可靠、高效的優點，已成為PCV2亞單位疫苗研究的趨勢。

迄今為止，人們已經研究出多種原核和真核表達系統用以生產基因工程疫苗。與其它系統相比，大腸桿菌表達系統具有遺傳背景清楚、操作簡便、培養周期短、可以大規模發酵培養、產量高、成本低等優點，是現階段常用的表達系統，也是用于PCV2 VLPs疫苗生產的理想表達系統。同時，大腸桿菌表達、制備的PCV2 VLPs中也有內毒素殘留、非VLPs蛋白等不利因素。現如今已有多種內毒素去除方法可以有效去除內毒素，將內毒素含量降至標準以內。因為PCV2單體蛋白上有衰減表位的存在，會大大降低疫苗的免疫效果，所以有必要除去PCV2 VLPs樣品中的非VLPs蛋白。目前多采用離子交換、分子篩等層析方法或超速離心來純化PCV2 VLPs，相對這些方法或耗時、或處理量小、或后期需要進一步濃縮等缺點，本研究開發了一種更為方便、快捷、簡單、低成本的PCV2 VLPs樣品中的非VLPs蛋白去除方法。

發明內容:

為提高PCV2 VLPs樣品中VLPs純度，降低因大量單體存在導致疫苗免疫效力下降，本發明提供一種熱處理去除PCV2 VLPs中非VLPs蛋白，同時去除部分雜蛋白的方法。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種熱處理去除PCV2 VLPs中非VLPs蛋白的方法，具體步驟如下：

1）E.coli BL21(DE3)/pET28a-cap搖瓶表達；

2）制備PCV2 VLPs粗樣品；

3）對大腸桿菌表達、制備的PCV2 VLPs樣品進行熱處理；