[發明專利]一種熱處理去除PCV2 VLPs中非VLPs蛋白的方法

有效

• 申請號: 201810364014.X
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108588154B
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 杜恩岐;李折折;石聿勇;肖何;張志剛
• 申請（專利權）人: 楊凌凱瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/01;C07K1/14;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/19
• 代理公司: 北京貴都專利代理事務所(普通合伙) 11649
• 代理人: 李新鋒

1.一種熱處理去除PCV2VLPs中非VLPs蛋白的方法，具體步驟如下：

1)E.coliBL21(DE3)/pET28a-cap搖瓶表達；

2)制備PCV2VLPs粗樣品；

3)對大腸桿菌表達、制備的PCV2VLPs樣品進行熱處理；

4)離心分離熱處理后的PCV2VLPs上清和沉淀，并對處理前后PCV2VLPs樣品進行SDS-PAGE檢測、瓊擴效價檢測、電鏡檢測；所述的步驟3)中的熱處理為65℃、30-50min。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟3)中的熱處理為65℃、30min。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟1)中表達宿主菌為E.coliBL21(DE3)。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟1)中E.coliBL21(DE3)/pET28a-cap搖瓶表達的步驟為：接種20μLE.coliBL21(DE3)/pET28a-cap甘油菌到裝有5mL含終濃度50μg/mLKana的LB液體培養基的試管中，37℃200rpm搖床培養過夜；按2％接種量轉接4mL過夜培養的E.coliBL21(DE3)/pET28a-cap菌液到裝有200mL含終濃度50μg/mLKana的LB液體培養基的500mL錐形瓶，37℃200rpm搖床培養；至OD600＝0.6時，加入0.4mMIPTG，37℃200rpm搖床培養，誘導表達3h；誘導結束8000rpm10min4℃離心收集菌體。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟2)中制備PCV2VLPs粗樣品的步驟為：按1g濕菌/10mLPBS重懸菌體，超聲波破碎，破碎功率為300W，工作3s間歇5s，共破碎10min；12000rpm20min4℃離心分離破菌上清和沉淀，取破菌上清用60％飽和度硫酸銨沉淀4h，12000rpm10min4℃離心收集沉淀，再用等體積PBS重懸，即為PCV2VLPs粗樣品。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟3)中所述的對大腸桿菌表達、制備的PCV2VLPs樣品進行熱處理的步驟為：將步驟2)中制備的PCV2VLPs粗樣品分裝到1.5mLEP管，1mL/支；將分裝的PCV2VLPs粗樣品置于65℃水浴鍋中水浴30-50min。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟4)中所述的瓊擴效價檢測步驟為：瓊脂板的制備，1g瓊脂糖加入100mLPBS緩沖液中，水浴加熱融化，稍涼45～60℃倒入平皿中，厚度約為3mm，待瓊脂糖凝固后加蓋，將平皿倒置，以防水分蒸發，放入4℃冰箱中保存備用；打孔，將瓊脂板放在預先畫好的圖樣上，用六角形打孔器在瓊脂板上按7孔梅花圖案打孔，孔徑3mm～4mm，孔距3mm，用針頭挑出孔內瓊脂，挑出時從孔一側邊緣插入針頭，輕輕移動，等空氣進入孔底后，再向上挑出，勿傷邊緣；封底，打孔完畢，封閉孔底將板底部在酒精燈上烘烤，使底部瓊脂微溶化即可，也可在瓊脂孔底部與板接觸處加少量溶化的瓊脂糖，以防側漏；加樣，用微量移液器滴加陽性血清于中間孔，設陰性對照孔，其余孔加被檢抗原，加樣時應將孔加滿，不應出現凹形面，也不應溢出，在本次實驗中中間孔為抗原，周圍孔為陽性血清；感作，將加好樣的瓊脂板，靜置5～10min，待孔內液體吸收，將瓊擴板加蓋保濕，放于37℃溫箱內作用24、48、72h觀察沉淀線。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟4)中電鏡檢測制樣步驟為：銅網經過10-30s的等離子清洗，碳面朝上；將一塊封口膜鋪在冰盒上冷卻；將銅網放在冰的封口膜上；封口膜上分別滴樣品、超純水、PTA染液各20μL；放置1-2min，將銅網、樣品、超純水、PTA冷卻；將銅網碳面扣在樣品液滴上吸附樣品1min，用濾紙與銅網垂直接觸吸掉多余液體，直至看不到殘留液體，持續吸水10s；將銅網碳面扣在PTA液滴上染色0.5-1min，用濾紙吸干；放置在濾紙上，在陰涼處自然干燥，即可用于電鏡觀察。