[發明專利]5-氨基乙酰丙酸高產菌株及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201810362420.2
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN108517327B
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 鄭平;陳久洲;孫際賓;周文娟;孫村民;郭軒;馬延和
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/77;C12N15/74;C12N1/21;C12P13/00
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;徐迅

本發明公開了一種構建5?氨基乙酰丙酸生產菌株的方法，即在所述5?氨基乙酰丙酸生產菌株表達ALA合成酶(ALAS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的基礎上使得所述5?氨基乙酰丙酸生產菌株的乙醛酸循環途徑弱化。本發明還公開了利用所述方法構建的ALA高產菌株和利用所述菌株制備ALA的方法。利用本發明的菌株可顯著提高ALA的產量。

技術領域

本發明涉及基因工程和微生物發酵技術領域。具體地說，本發明涉及5-氨基乙酰丙酸的高產菌株及其制備方法和應用。

背景技術

5-氨基乙酰丙酸(ALA)是一種重要的高附加值生物基化工產品，在農業、醫藥等領域應用廣泛。目前ALA主要通過化學合成法合成，成本高污染重，限制了其在各領域的推廣應用。由于具備低成本和無污染的優勢，利用微生物發酵法合成ALA逐漸成為研究的熱點。

生物體內ALA主要有兩種合成途徑(C4途徑和C5途徑)，強化途徑中關鍵酶的表達作為常規途徑已被廣泛用于ALA高產菌株的構建(CN101063104A、CN102206606A等)。現有技術針對ALA合成的代謝途徑改造主要是通過增加底物琥珀酰輔酶A的供給或降低產物ALA的消耗來提高ALA產量，例如增強四碳回補途徑(CN103981203B)、強化輔酶A供給途徑(CN103710374A)、弱化ALA下游代謝途徑(CN103695364A/CN104830748A)等。另有研究發現增強轉運蛋白的表達可以提高ALA產量(CN106047916A、CN106434513A等)。

此外，目前也有科研人員對乙醛酸循環進行了研究，發覺通過增強乙醛酸循環能夠提高某些代謝產物的產量。進一步地，也有人通過強化乙醛酸循環提高了ALA的產量，從而認為乙醛酸循環強化有利于ALA的合成。然而，考慮到微生物代謝的復雜性，該結論是否普遍適用仍然存疑。

目前現有技術中ALA的產量仍有很大的提升空間，因此本領域仍需要進一步提高ALA的產量，從而能夠高效、低成本、低污染地制備ALA。

發明內容

本發明的目的在于提供一種5-氨基乙酰丙酸高產菌株的構建方法以及利用這種構建方法構建得到的5-氨基乙酰丙酸高產菌株。

本發明的目的還在于利用本發明的5-氨基乙酰丙酸高產菌株產生ALA，從而能夠高效、低成本、低污染地制備ALA。

在第一方面，本發明提供一種5-氨基乙酰丙酸生產菌株的構建方法，所述方法包括：

使得所述5-氨基乙酰丙酸生產菌株的乙醛酸循環弱化。

在具體的實施方式中，所述乙醛酸循環弱化是指乙醛酸循環所涉及的異檸檬酸裂解酶和/或蘋果酸合酶的活性部分或完全缺失。

在優選的實施方式中，所述乙醛酸循環弱化是指異檸檬酸裂解酶和/或蘋果酸合酶的活性下降；或者，異檸檬酸裂解酶或蘋果酸合酶的活性完全喪失；或者，異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合酶活性均喪失。

在優選的實施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸生產菌株本身表達ALA合成酶(ALAS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)；或者所述5-氨基乙酰丙酸生產菌株中ALA合成酶(ALAS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的活性增強。

在優選的實施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸生產菌株中ALA合成酶(ALAS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的活性增強可以通過以下方法之一或組合實現：表達同源或異源ALA合成酶和酸烯醇式丙酮酸羧化酶的編碼基因，和/或增加所述菌株中所述編碼基因的拷貝數，和/或改造所述編碼基因的啟動子以增強轉錄啟動速度，和/或修改攜帶有所述編碼基因的信使RNA的翻譯調控區以增強翻譯強度。

在優選的實施方式中，所述構建方法包括：

1)使得所述5-氨基乙酰丙酸生產菌株表達ALA合成酶(ALAS)或增強所述5-氨基乙酰丙酸生產菌株中ALA合成酶(ALAS)的活性；