[發明專利]一種肝細胞miR-199b低表達的慢病毒表達載體及其構建方法

有效

• 申請號: 201810362418.5
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN108517335B
• 公開（公告）日: 2019-11-26
• 發明（設計）人: 劉建軍;任曉虎;阮嘉雯;劉威;黃新鳳
• 申請（專利權）人: 深圳市疾病預防控制中心(深圳市衛生檢驗中心;深圳市預防醫學研究所)
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66
• 代理公司: 44451 深圳市添源知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 黎健任<國際申請>=<國際公布>=<進入

本發明提供一種肝細胞miR?199b低表達的慢病毒表達載體，包括pLVX?shRNA2?puro病毒載體的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列和tudmiRNA?199b重組質粒；所述多克隆位點序列包括Hind III酶切位點和BamH I酶切位點，所述tudmiRNA?199b重組質粒正向插入所述多克隆位點序列中。本發明屬于基因工程技術領域，本發明提供的重組慢病毒表達載體具有轉染效率高，用量少的優點，可在人源肝細胞中持續、高效、穩定地抑制miRNA?199b表達。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其涉及一種肝細胞miR-199b低表達的慢病毒表達載體及其構建方法。

背景技術

miRNA是一類進化保守的內源性的非編碼小分子，普遍存在于多樣性生物體內參與基因調控。miRNA主要調控著編碼蛋白的基因表達，其作用機制是降解與其互補結合的mRNA 或抑制不完全配對的mRNA翻譯，具有非常重要的生物學作用。

miRNA是在細胞核內DNA聚合酶Ⅱ作用下由DNA轉錄成為初級miRNA (pri-miRNA)。miRNA在核內酶RNaseⅢ-Drosha的作用下加工剪切為六七十個核苷酸序列的發夾結構前體pre-miRNA，然后再依賴RNA的核轉運受體家族成員輸出蛋白Exportin-5 的作用下轉運到胞漿。在胞漿RNaseⅢDicer酶作用下二次加工為單鏈的成熟miRNA，與 RNA誘導沉默復合物結合形成RISC，識別靶mRNA后抑制其翻譯或通過去腺苷酸化和脫帽作用致使mRNA降解。對miRNA進行tud(tough decoy)處理得到tudmiRNA，通常可以提高miRNA的抑制效果，但是實際應用中，由于tudmiRNA的結構較復雜，使表達tudmiRNA 的重組載體構建難度較大。

通過miRNA靶基因預測軟件查找能與SET基因3’-UTR互補結合的miRNAs，包括miRNA-23a，miRNA-21,miRNA-199b,miRNA-20a,miRNA-29b，miRNA-194,miRNA-221, miRNA-129等。中國專利申請CN 105925613A公開了一種促進肝細胞miR-199b高表達的慢病毒表達載體及其構建方法，通過將含有綠色熒光基因的Pri-miRNA-199b序列產物與 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro病毒載體連接得到的重組慢病毒表達載體具有轉染效率高，可在肝細胞中持續、高效、穩定地提高miRNA-199b表達。

通過調節miRNA-199b表達，可能在制備治療miRNA-199b表達異常相關疾病藥物的開發中起到作用，但現有技術尚可穩定低表達miRNA-199b的重組載體。因此，提供一種肝細胞miR-199b低表達的慢病毒表達載體及其構建方法具有重要意義。

發明內容

為解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種肝細胞miR-199b低表達的慢病毒表達載體及其構建方法，從可能影響SET基因表達的眾多miRNAs中篩選出miRNA-199b，通過tud 處理得到tudmiRNA-199b，引進Hind III和Bgl II特異性酶切位點后與pLVX-shRNA2表達載體重組得到tudmiRNA-199b重組質粒，再經Hind III和BamH I限制性內切酶進行雙酶切后，與pLVX-shRNA2-puro病毒載體連接，得到可穩定低表達miR-199b的重組慢病毒表達載體，具有轉染效率高，用量少的優點，可在人源肝細胞中持續、高效、穩定地抑制miRNA-199b 表達，實現穩定低表達miRNA-199b，進而對SET基因表達起到調控作用。

本發明提供一種肝細胞miR-199b低表達的慢病毒表達載體，包括pLVX-shRNA2-puro病毒載體的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列和tudmiRNA-199b重組質粒；所述多克隆位點序列包括Hind III酶切位點和BamH I酶切位點，所述tudmiRNA-199b 重組質粒正向插入所述多克隆位點序列中。