[發(fā)明專(zhuān)利]一種肝細(xì)胞miR-199b低表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810362418.5
• 申請(qǐng)日: 2018-04-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108517335B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-11-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉建軍;任曉虎;阮嘉雯;劉威;黃新鳳
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 深圳市疾病預(yù)防控制中心(深圳市衛(wèi)生檢驗(yàn)中心;深圳市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/867
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/867;C12N15/66
• 代理公司: 44451 深圳市添源知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)
• 代理人: 黎健任<國(guó)際申請(qǐng)>=<國(guó)際公布>=<進(jìn)入

1.一種肝細(xì)胞miR-199b低表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體，其特征在于：包括pLVX-shRNA2-puro病毒載體的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點(diǎn)序列、啟動(dòng)子序列和tudmiRNA-199b序列；所述多克隆位點(diǎn)序列包括Hind III酶切位點(diǎn)和BamH I酶切位點(diǎn)，所述tudmiRNA-199b序列正向插入所述多克隆位點(diǎn)序列中；所述tudmiRNA-199b序列為：

GGATCCGGTGGCGCTAGGATCATCAACCCCAGTGTTTAGAATCTCTATCTGTTCCAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACCCCAGTGTTTAGAATCTCTATCTGTTCCAAGATGATCCTAGCGCCACCTTTTTTGAATTC，即SEQ IDNO：1。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝細(xì)胞miR-199b低表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于：包括如下步驟：

S1：tudmiRNA-199b序列的設(shè)計(jì)：通過(guò)miRBase庫(kù)找到與SET基因關(guān)聯(lián)的miRNA-199b基因的反向互補(bǔ)序列，并引進(jìn)Hind III和Bgl II特異性酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)tudmiRNA-199b序列為：GGATCCGGTGGCGCTAGGATCATCAACCCCAGTGTTTAGAATCTCTATCTGTTCCAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACCCCAGTGTTTAGAATCTCTATCTGTTCCAAGATGATCCTAGCGCCACCTTTTTTGAATTC，即SEQ ID NO：1；

S2：合成得到tudmiRNA-199b序列；

S3：tudmiRNA-199b重組質(zhì)粒的獲得：pLVX-shRNA2表達(dá)載體和步驟S2得到的tudmiRNA-199b序列分別經(jīng)Hind III和Bgl II限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切后，T4 DNA連接酶連接得到連接產(chǎn)物，將該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，均勻涂布到含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基平板上，挑取陽(yáng)性單克隆菌落培養(yǎng)保存菌液并進(jìn)行PCR初步鑒定，將初步鑒定結(jié)果說(shuō)明tudmiRNA-199b序列插入成功的菌液進(jìn)行測(cè)序鑒定，將測(cè)序鑒定正確的大腸桿菌培養(yǎng)并抽提，得到含tudmiRNA-199b序列的tudmiRNA-199b重組質(zhì)粒；

S4：肝細(xì)胞miR-199b低表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建：將pLVX-shRNA2-puro病毒載體、步驟S3獲得的含tudmiRNA-199b序列的tudmiRNA-199b重組質(zhì)粒分別用Hind III和BamH I限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切后，T4 DNA連接酶連接，得到肝細(xì)胞miR-199b低表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肝細(xì)胞miR-199b低表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于：所述肝細(xì)胞為HL-7702細(xì)胞，所述感受態(tài)大腸桿菌為JM 109。