[發(fā)明專利]一種固定化脂肪酶及其制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810362084.1
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN108486094A
• 公開（公告）日: 2018-09-04
• 發(fā)明（設計）人: 胡云峰;徐珊;李任強;張繼福;張云;孫愛君
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

本發(fā)明公開了一種固定化脂肪酶及其制備方法。本發(fā)明用1.0mol/L的pH為6.0的磷酸鉀緩沖液溶解脂肪酶酶粉制備濃度為2.0mg/mL的酶液，10000r/min離心后得到澄清酶液，按照5.0g：4mL的比例將型號為LXEP?120的環(huán)氧樹脂置于酶液中，在150rpm、22℃條件下固定化12h，然后用1.0mol/L的pH為6.0的磷酸鉀緩沖液溶洗滌3次，抽濾，于40℃干燥，得到固定化脂肪酶；其酶活約為400U/g，酶活回收率達到92.79％，具有良好的pH耐受性、溫度耐受性、操作穩(wěn)定性以及儲存穩(wěn)定性，符合工業(yè)應用的需要。

技術(shù)領域

本發(fā)明屬于生物化工和生物技術(shù)領域，具體涉及一種固定化脂肪酶及其制備方法。

背景技術(shù)

脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)，是一類十分重要的生物催化劑，能分解底物產(chǎn)生各種天然油脂。作為一種生物催化劑，脂肪酶具有催化效率高、專一性強、副產(chǎn)物少、反應條件溫和的特點，被廣泛地應用到手性化合物的拆分、生物柴油的制備、食品加工和日用化工等行業(yè)。但是，由于游離酶本身存在的穩(wěn)定性差、分離回收困難和難以實現(xiàn)反復連續(xù)利用等缺陷，很大程度上限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的實際應用。為了解決游離酶存在的以上缺點，真正將酶制劑應用到工業(yè)生產(chǎn)中去，人們開展了酶的固定化研究。

酶的固定化方法有多種，較為常用的有吸附法、包埋法、交聯(lián)法和共價結(jié)合法。共價結(jié)合法固定化酶是把酶的非活性側(cè)鏈基團和載體中的活性官能團共價鍵合，固定化得到的酶通常具有良好的穩(wěn)定性，在連續(xù)使用的過程中酶活損失較小，是目前較為受青睞的一種固定化方法。利用共價鍵固定化的官能團載體有很多種，較為常用的有羧基類、氨基類和環(huán)氧基類。由于環(huán)氧基團具有很高的活性和可塑性，在常溫下就可以與酶蛋白表面的氨基酸殘基(-NH₂、-COOH、-HS等)發(fā)生溫和的開環(huán)共價結(jié)合，從而將酶分子固定在載體表面。并且，由于一些合成的樹脂載體在較長的生產(chǎn)周期內(nèi)具有很強的耐微生物、耐堿腐蝕作用和較強的機械性能，所以利用含有環(huán)氧基團的樹脂來固定化酶，在通常情況下可以得到穩(wěn)定性較好、機械性能較強的固定化酶，能夠較好地適應復雜的工業(yè)操作環(huán)境。

目前，用于工業(yè)酶固定化的環(huán)氧樹脂主要是Eupergit C等國外公司生產(chǎn)的環(huán)氧樹脂，但是國外進口的環(huán)氧樹脂價格較為昂貴，從國外進口需要花費大量的外匯資源。因此，開發(fā)基于國產(chǎn)環(huán)氧樹脂進行工業(yè)酶的固定化方法，以減少對國外公司生產(chǎn)的昂貴的環(huán)氧樹脂的依賴，很有必要。而目前基于環(huán)氧樹脂載體的固定化脂肪酶的報道較少。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了減少對國外公司生產(chǎn)的昂貴的環(huán)氧樹脂的依賴，利用國產(chǎn)的環(huán)氧樹脂替代進口的環(huán)氧樹脂，通過優(yōu)化固定化過程，得到性能更為優(yōu)異的環(huán)氧樹脂固定化脂肪酶，提供一種經(jīng)濟實用的固定化脂肪酶及其制備方法。

本發(fā)明通過對國產(chǎn)的環(huán)氧樹脂進行篩選，使用國產(chǎn)環(huán)氧樹脂LXEP-120固定化脂肪酶，研究了影響固定化效果的多個重要參數(shù)，確定了最佳的固定化工藝，并分析了制備的環(huán)氧樹脂固定化脂肪酶的酶學性質(zhì)以及穩(wěn)定性。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種固定化脂肪酶的制備方法，包括以下步驟：

將脂肪酶溶于pH 5.5～8.5的緩沖液中，10000r/min離心得到脂肪酶酶液，按照環(huán)氧樹脂：脂肪酶酶液為0.5～7g：4mL的比例將環(huán)氧樹脂放入酶液中，在18～28℃條件下固定化12～24h；然后洗滌、抽濾、干燥。

優(yōu)選，所述的環(huán)氧樹脂為環(huán)氧樹脂LXEP-120、LX-1000EP、ES-1、ES-3、ES-5或ES-7。

更優(yōu)選的，所述的環(huán)氧樹脂為環(huán)氧樹脂LXEP-120。

優(yōu)選，所述的緩沖液為磷酸鉀緩沖液、磷酸鈉緩沖液、檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液、Tris-HCl緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。

優(yōu)選，所述的緩沖液為濃度為1.0mol/L的pH 6.0的磷酸鉀緩沖液。