[發明專利]一種線性擴增雙鏈DNA的方法及應用有效

申請號：	201810361588.1	申請日：	2018-04-20
公開（公告）號：	CN110387399B	公開（公告）日：	2023-04-18
發明（設計）人：	王力剛	申請（專利權）人：	北京全譜醫學檢驗實驗室有限公司
主分類號：	C12Q1/6806	分類號：	C12Q1/6806
代理公司：	北京卓孚律師事務所 11821	代理人：	謝夢欣
地址：	100000 北京市大興區北京經***	國省代碼：	北京;11
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種線性擴增 dna 方法應用
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【說明書】：

本發明的目的之一是提供一種線性擴增雙鏈DNA的方法，使用該方法可以快速穩定的將目標DNA進行線性轉錄為RNA，以實現線性擴增，并通過逆轉錄方法轉化為DNA文庫。本發明的目的之二是提供一種腫瘤低頻率突變檢測的應用，使用該應用可以檢測低于1%的低水平突變。為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：本發明提供了一種線性擴增雙鏈DNA的方法，具體通過在雙鏈DNA一端連接RNA聚合酶識別的啟動子序列，繼而使用RNA聚合酶擴增為大量RNA，并逆轉錄成DNA。

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種線性擴增雙鏈DNA的方法及其應用。

背景技術

在自然界，基因突變是經常發生的，突變如果發生在與細胞增殖有關的基因，就可能導致細胞擺脫正常的生長控制，表現出惡性細胞的表型性狀。許多致癌物都是致突變物。它們大多數能引起DNA的損傷。這些損傷可以修復，也可以導致細胞死亡。如果DNA的修復不正常，細胞雖可繼續存活，但卻成了潛在的癌細胞。

對腫瘤細胞突變的檢測主要技術難點在于腫瘤突變的頻率很低，尤其是當突變頻率在低于1%時，容易由PCR擴增系統產生的誤差導致檢測不準確。

而針對這個技術難點，較為常見的方法有數字液滴PCR技術和深度測序技術。深度測序技術包括捕獲測序與線性擴增和分子標簽技術。數字液滴PCR技術是通過將每個DNA模板分散到單獨的液滴中進行擴增檢測，檢測靈敏度高，準確性好，但是檢測位點通量較少。捕獲測序是通過設計目標區域的探針，針對性的捕獲靶向區域；目前的線性擴增方法主要是將待檢的DNA形成單鏈結構，通過接頭、或環化酶的作用將單鏈DNA連接成環，此方法成環效率低，步驟繁瑣，反應條件要求嚴格。分子標簽技術是通過在PCR擴增中對原始模板初級產物添加唯一的標簽序列，但是缺點也沒明顯，要合成含有百萬種以上的分子標簽的相同引物，價格昂貴，且在擴增中容易丟失不完整擴增子的DNA片段，導致檢測信息丟失，擴增過程中因擴增偏好性，產物擴增水平不一致。

因此，尋找一種檢測通量高，成功率高，檢測準確，可靠、經濟、快速的技術尤為重要

發明內容

本發明的目的之一是提供一種線性擴增雙鏈DNA的方法，使用該方法可以快速穩定的將目標DNA進行線性轉錄為RNA，以實現線性擴增，并通過逆轉錄方法轉化為DNA文庫。

本發明的目的之二是提供一種腫瘤低頻率突變檢測的應用，使用該應用可以檢測低于1%的低水平突變。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明提供了一種線性擴增雙鏈DNA的方法，具體通過在雙鏈DNA一端連接RNA聚合酶識別的啟動子序列，繼而使用RNA聚合酶擴增為大量RNA，并逆轉錄成DNA。

進一步，所述的雙鏈DNA末端為平末端，或特定的粘性末端，如3’A結構。

進一步，所述的RNA聚合酶識別的啟動子序列可以為T7?RNA聚合酶啟動子序列、T3RNA聚合酶啟動子序列，SP6?RNA聚合酶啟動子序列等。

進一步，所述的逆轉錄是指通過逆轉錄酶，及特異性通用引物，將擴增產生的RNA為模板轉化為DNA序列。

進一步，所述的特異性通用引物為特定的核苷酸序列。

本發明的優點和有益效果：

本發明提供了一種線性擴增雙鏈DNA的方法，使用該方法可以糾正因PCR擴增系統誤差導致低水平突變檢測不準確的問題，且擴增效率高，操作簡單，成本低，便于應用于腫瘤突變DNA的檢測，尤其是游離腫瘤DNA。