[發(fā)明專利]一種利用CRISPR/Cas9編輯大白豬CD163基因的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810361147.1
• 申請(qǐng)日: 2018-04-20
• 公開（公告）號(hào): CN108753832A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何祖勇;郭春和;劉小鳳;叢佩清;王敏;劉小紅;陳瑤生
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/90
• 分類號(hào): C12N15/90;C12N15/113;C12N15/85
• 代理公司: 廣州新諾專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44100
• 代理人: 劉婉

本發(fā)明公開了一種利用CRISPR/Cas9編輯大白豬CD163基因的方法，利用CRISPR/Cas9編輯大白豬CD163基因，破壞CD163受體胞外域SRCR5，敲除CD163基因第7個(gè)外顯子DNA片段，CD163基因的第7個(gè)外顯子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。采用本發(fā)明的方法，能夠完全抵抗PRRSV感染，包括抗高致病性毒株HP?PRRSV，而細(xì)胞表面CD163受體表達(dá)正常，其他生物學(xué)功能正常。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)，涉及一種利用CRISPR/Cas9編輯大白豬CD163基因的方法。

背景技術(shù)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又稱藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome viruse，PRRSV)引起，PRRS主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔及各年齡階段豬特別是仔豬呼吸道癥狀，特征性病變?yōu)殚g質(zhì)性肺炎，死亡率極高，是一種高度接觸性的全球性的重要傳染病。2006年，我國(guó)爆發(fā)了豬高熱病，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，后來(lái)將此毒株定義為高致病型毒株(Highly pathogenic porcinereproductive and respiratory syndrome viruse，HP-PRRSV)，目前，高致病性藍(lán)耳病(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS)是對(duì)養(yǎng)豬業(yè)損害最大的疾病之一，由于該病毒具有免疫抑制性、抗體依賴增強(qiáng)性、持續(xù)性感染、病毒血癥維持時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，目前尚沒有很好的疫苗和藥物可以防控藍(lán)耳病。

CD163是單核細(xì)胞、豬肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine alveolar macrophage,PAMs)表面特異表達(dá)的富含半胱氨酸清道夫受體(cysteine-rich scavenger receptor,SRCR)，一般可作為PAMs細(xì)胞Marker。CD163共含有9個(gè)SRCR結(jié)構(gòu)域，其中SRCR5在病毒感染過(guò)程中發(fā)揮主要的作用，有研究表明，SRCR5的缺失或破壞能抑制PRRSV的感染。同時(shí)有體外實(shí)驗(yàn)證明，SRCR5主要由CD163基因的外顯子7負(fù)責(zé)編碼。該發(fā)現(xiàn)為構(gòu)建抗PRRSV的CD163基因編輯動(dòng)物提供了依據(jù)，即通過(guò)基因編輯技術(shù)結(jié)合體細(xì)胞核移植的方法，制備出SRCR5被破壞的抗PRRSV的CD163基因編輯動(dòng)物。有研究報(bào)道CD163受體敲除豬可以完全抵抗PRRSV感染，沒有任何如發(fā)熱、呼吸困難等癥狀，體內(nèi)檢測(cè)不到任何PRRSV抗原和抗體，組織切片顯示肺部沒有被PRRSV感染。

Cas9和gRNA是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基本成分，gRNA用于特異位點(diǎn)識(shí)別，Cas9用于切割靶位點(diǎn)DNA。與傳統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建更加簡(jiǎn)便、快速、廉價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)gRNA的靶位點(diǎn)位于同一條染色體上時(shí)，利用Cas9和多條gRNA共轉(zhuǎn)細(xì)胞，可以產(chǎn)生兩條gRNA靶位點(diǎn)之間DNA片段的刪除，DNA片段刪除能更有效地敲除目的基因。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)以上要解決的技術(shù)問(wèn)題，提供一種能夠有效敲除目的基因的利用CRISPR/Cas9編輯大白豬CD163基因的方法。

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種利用CRISPR/Cas9編輯大白豬CD163基因的方法，其利用CRISPR/Cas9編輯大白豬CD163基因，破壞CD163受體胞外域SRCR5，敲除CD163基因第7個(gè)外顯子DNA片段，所述CD163基因的第7個(gè)外顯子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根據(jù)本發(fā)明提供的方法，優(yōu)選地，用于敲除所述CD163基因的所述第7個(gè)外顯子的gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

所述藍(lán)耳病毒包括經(jīng)典毒株和高致病性毒株。具體優(yōu)選地，所述高致病性毒株為高致病性藍(lán)耳病病毒HP-PRRSV。