[發(fā)明專利]一種水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810360352.6
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN108315347A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉寒冬
• 申請（專利權(quán)）人: 劉寒冬
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 沈陽維特專利商標事務(wù)所(普通合伙) 21229
• 代理人: 楊群

本發(fā)明屬于植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，特別提供了一種水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟：愈傷誘導(dǎo)、制備侵染液、侵染、共培養(yǎng)、脫菌?篩選、分化、生根培養(yǎng)，得到水稻的帶有Kan抗性基因的水稻遺傳轉(zhuǎn)化植株。本方法過程簡單、操作方便、參數(shù)及培養(yǎng)基優(yōu)化，能夠在較短時間內(nèi)獲得高遺傳轉(zhuǎn)化率的水稻轉(zhuǎn)基因植株。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，特別提供了一種水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)

水稻是世界上分布最廣、最為重要的糧食作物之一，其遺傳轉(zhuǎn)化一直受到大家的重視。傳統(tǒng)水稻的品種改良方法一般是通過品種雜交、遠緣雜交等，其轉(zhuǎn)基因技術(shù)起源于1988年，到目前為止，其遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)發(fā)展的較為完善。但是，仍然存在著轉(zhuǎn)化時間長、轉(zhuǎn)化效率低等問題。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法，通過調(diào)整過程中的培養(yǎng)基及培養(yǎng)參數(shù)，大大縮短了水稻遺傳轉(zhuǎn)化的時間，并且提高了遺傳轉(zhuǎn)化率。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟：

1)愈傷誘導(dǎo)

水稻種子的滅菌：用75％的乙醇滅菌5min，再用25％NaClO，加1滴吐溫，于搖床200rpm，震蕩處理40min；使用無菌水清洗3-5次，用滅菌濾紙吸干表面水分；

愈傷誘導(dǎo)：將滅菌后的種子，放到Os1培養(yǎng)基上，31℃培養(yǎng)室中16h光照/8h黑暗培養(yǎng)8-10天；定期查看愈傷生長狀態(tài)，有無長菌情況，待愈傷組織長至約與種子大小一致、呈金黃色時，即可用于侵染；

2)制備侵染液

取50ml Os-inf，加入100μl AS，將農(nóng)桿菌挑至混合液中，制成侵染液；

3)侵染

將調(diào)好的侵染液加至水稻愈傷中，放置搖床100rpm侵染30min，取出用無菌濾紙吸干；

4)共培養(yǎng)

將步驟3)吹至表面無液體的愈傷組織接至Os-cocu培養(yǎng)基，暗處培養(yǎng)3天，至每個侵染后的愈傷組織周圍農(nóng)桿菌長勢良好，證明侵染成功；

5)脫菌-篩選

脫菌：200ml無菌水加cef 400微升，終濃度500mg/L，分5次清洗愈傷：第1-2次，輕搖清洗后棄去廢液；第3次搖床100rpm，震蕩清洗90min；第4-5次，輕搖清洗后棄去廢液，最后，用無菌濾紙吸干愈傷；

篩選：將吸干的愈傷，接至Os-Hn篩選培養(yǎng)基，每隔10天繼代1次，繼代至第3-4次時，外植體周圍出現(xiàn)新生長的金黃色愈傷，為篩選成功的愈傷；

6)分化

將篩選出的陽性愈傷接至Os2-Hn分化培養(yǎng)基，每隔10-15d進行一次繼代，繼代3-4次，期間：分化開始15d，愈傷開始出現(xiàn)綠色；最終分化成功的愈傷再經(jīng)25-30d成3-5cm幼苗；

7)生根

將長至3-5cm的陽性幼苗清理好基部愈傷，接種至Os3培養(yǎng)基8-12天，至長出1-2條新生根；

各步驟中用到的培養(yǎng)基具體配方見下表：

上述培養(yǎng)基配方表中的各個代碼代表含義為：

進一步地，所述愈傷誘導(dǎo)過程中，Os1培養(yǎng)基上每皿接種18粒種子。

進一步地，所述步驟2)中制備的侵染液OD₆₀₀＝1.0。