[發明專利]一種水稻遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 201810360352.6
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN108315347A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 劉寒冬
• 申請（專利權）人: 劉寒冬
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 沈陽維特專利商標事務所(普通合伙) 21229
• 代理人: 楊群

1.一種水稻遺傳轉化方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)愈傷誘導

水稻種子的滅菌：用75％的乙醇滅菌5min，再用25％NaClO，加1滴吐溫，于搖床200rpm，震蕩處理40min；使用無菌水清洗3-5次，用滅菌濾紙吸干表面水分；

愈傷誘導：將滅菌后的種子，放到Os1培養基上，31℃培養室中16h光照/8h黑暗培養8-10天；定期查看愈傷生長狀態，有無長菌情況，待愈傷組織長至約與種子大小一致、呈金黃色時，即可用于侵染；

2)制備侵染液

取50ml Os-inf，加入100μl AS，將農桿菌挑至混合液中，制成侵染液；

3)侵染

將調好的侵染液加至水稻愈傷中，放置搖床100rpm侵染30min，取出用無菌濾紙吸干；

4)共培養

將步驟3)吹至表面無液體的愈傷組織接至Os-cocu培養基，暗處培養3天，至每個侵染后的愈傷組織周圍農桿菌長勢良好，證明侵染成功；

5)脫菌-篩選

脫菌：200ml無菌水加cef 400微升，終濃度500mg/L，分5次清洗愈傷：第1-2次，輕搖清洗后棄去廢液；第3次搖床100rpm，震蕩清洗90min；第4-5次，輕搖清洗后棄去廢液，最后，用無菌濾紙吸干愈傷；

篩選：將吸干的愈傷，接至Os-Hn篩選培養基，每隔10天繼代1次，繼代至第3-4次時，外植體周圍出現新生長的金黃色愈傷，為篩選成功的愈傷；

6)分化

將篩選出的陽性愈傷接至Os2-Hn分化培養基，每隔10-15d進行一次繼代，繼代3-4次，期間：分化開始15d，愈傷開始出現綠色；最終分化成功的愈傷再經25-30d成3-5cm幼苗；

7)生根

將長至3-5cm的陽性幼苗清理好基部愈傷，接種至Os3培養基8-12天，至長出1-2條新生根；

各步驟中用到的培養基具體配方見下表：

上述培養基配方表中的各個代碼代表含義為：

2.如權利要求1所述的水稻遺傳轉化方法，其特征在于，所述愈傷誘導過程中，Os1培養基上每皿接種18粒種子。

3.如權利要求1所述的水稻遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟2)中制備的侵染液OD₆₀₀＝1.0。

4.如權利要求1所述的水稻遺傳轉化方法，其特征在于，選用的農桿菌為EHA105，載體骨架為Pcambia1300，攜帶的為Kan抗性基因。