[發(fā)明專利]一種鳥類多瘤病毒PCR診斷試劑盒及其檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810359774.1
• 申請(qǐng)日: 2018-04-20
• 公開（公告）號(hào): CN108315492A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱小甫;吳旭錦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 西安睿通知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 61218
• 代理人: 惠文軒

本發(fā)明提供了一種鳥類多瘤病毒PCR診斷試劑盒及其檢測(cè)方法，該鳥類多瘤病毒PCR診斷試劑盒，包括：裂解液、擴(kuò)增反應(yīng)混合液、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照；其中，所述裂解液的成分為DNAiso Reagent；所述擴(kuò)增反應(yīng)混合液包含滅菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、APV?F上游引物、APV?R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述陰性對(duì)照為滅菌三蒸水；所述陽(yáng)性對(duì)照為鳥類多瘤病毒陽(yáng)性質(zhì)粒。該試劑盒靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性高、結(jié)果直觀，其檢測(cè)方法易于操作、方便快捷，能大幅縮短檢測(cè)時(shí)間，為臨床控制鳥類多瘤病毒感染提供有力的技術(shù)手段，尤其在鸚鵡鳥類多瘤病毒感染快速診斷方面有重要作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動(dòng)物醫(yī)學(xué)動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鳥類多瘤病毒PCR診斷試劑盒及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

鳥類多瘤病毒(Avian Polyoma Virus，APV)首先在虎皮鸚鵡感染病例中發(fā)現(xiàn)，又名法蘭西斯掉羽癥。感染的虎皮鸚鵡主要癥狀是腹部及背部長(zhǎng)不出絨羽。后來(lái)又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)金剛鸚鵡、錐尾鸚鵡、月輪、凱克、愛(ài)情鳥、吸蜜鸚鵡、亞馬遜鸚鵡、灰鸚、鷹頭、及巴丹等鸚鵡亦可感染，成為鸚鵡的一種重要病原。

APV為多瘤病毒屬(Polyomavirus)，多瘤病毒科(Polyomaviridae)成員，20面體對(duì)稱，環(huán)狀雙股DNA。病毒在患病鸚鵡的血液、羽屑、糞便、嗉囊分泌物中均可發(fā)現(xiàn)，其中羽屑為最重要的散布來(lái)源。幼齡鸚鵡發(fā)病死亡率高達(dá)30％～100％。5-16周齡感染出現(xiàn)厭食、精神沉郁、下痢、麻痹、嗉囊排空時(shí)間延長(zhǎng)、嘔吐、皮下出血等臨床癥狀。由于本病對(duì)鸚鵡危害極大，羽毛發(fā)育不良嚴(yán)重影響鸚鵡的觀賞性，因此是鸚鵡需要著重預(yù)防和檢疫的傳染病。目前，缺乏診斷技術(shù)對(duì)鳥類多瘤病毒感染進(jìn)行快速診斷，無(wú)法快速控制疫情。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種鳥類多瘤病毒PCR診斷試劑盒及其檢測(cè)方法，該試劑盒靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性高、結(jié)果直觀，其檢測(cè)方法易于操作、方便快捷，能大幅縮短檢測(cè)時(shí)間，為臨床控制鳥類多瘤病毒感染提供有力的技術(shù)手段，尤其在鸚鵡鳥類多瘤病毒感染快速診斷方面有重要作用。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。

(一)一種鳥類多瘤病毒PCR診斷試劑盒，包括：裂解液、擴(kuò)增反應(yīng)混合液、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照；其中，所述裂解液的成分為DNAiso Reagent；所述擴(kuò)增反應(yīng)混合液包含滅菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、APV-F上游引物、APV-R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述陰性對(duì)照為滅菌三蒸水；所述陽(yáng)性對(duì)照為鳥類多瘤病毒陽(yáng)性質(zhì)粒。

優(yōu)選的，所述APV-F上游引物的序列為：5’-GTATGTATGACCCATAGAA-3’，所述APV-R下游引物的序列為：5’-GCAGCAGGAGAAGCCTCAGGG-3’。

優(yōu)選的，所述裂解液的成分為DNAiso Reagent，20個(gè)反應(yīng)共計(jì)20mL，裝成1瓶；所述擴(kuò)增反應(yīng)混合液包含滅菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L^-1dNTP、25μmol·L^-1APV-F上游引物、25μmol·L^-1APV-R下游引物和5U/μL rTaq DNA聚合酶，每個(gè)反應(yīng)體積比為17.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5，共計(jì)23μL，20個(gè)反應(yīng)共計(jì)460μL，裝成1管；所述陰性對(duì)照為滅菌三蒸水，20個(gè)反應(yīng)共計(jì)2.0mL，裝成1瓶；所述陽(yáng)性對(duì)照為鳥類多瘤病毒陽(yáng)性質(zhì)粒，20個(gè)反應(yīng)共計(jì)40.0μL，裝成1管。

優(yōu)選的，所述鳥類多瘤病毒為鸚鵡鳥類多瘤病毒。

(二)一種鳥類多瘤病毒PCR診斷試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下檢測(cè)步驟：

步驟1，DNA提取