[發(fā)明專利]一種鳥類多瘤病毒PCR診斷試劑盒及其檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810359774.1
• 申請(qǐng)日: 2018-04-20
• 公開（公告）號(hào): CN108315492A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱小甫;吳旭錦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 西安睿通知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 61218
• 代理人: 惠文軒

1.一種鳥類多瘤病毒PCR診斷試劑盒，其特征在于，包括：裂解液、擴(kuò)增反應(yīng)混合液、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照；其中，所述裂解液的成分為DNAiso Reagent；所述擴(kuò)增反應(yīng)混合液包含滅菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、APV-F上游引物、APV-R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述陰性對(duì)照為滅菌三蒸水；所述陽(yáng)性對(duì)照為鳥類多瘤病毒陽(yáng)性質(zhì)粒。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鳥類多瘤病毒PCR診斷試劑盒，其特征在于，所述APV-F上游引物的序列為：5’-GTATGTATGACCCATAGAA-3’，所述APV-R下游引物的序列為：5’-GCAGCAGGAGAAGCCTCAGGG-3’。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鳥類多瘤病毒PCR診斷試劑盒，其特征在于，所述裂解液的成分為DNAiso Reagent，20個(gè)反應(yīng)共計(jì)20mL，裝成1瓶；所述擴(kuò)增反應(yīng)混合液包含滅菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L^-1dNTP、25μmol·L^-1APV-F上游引物、25μmol·L^-1APV-R下游引物和5U/μL rTaq DNA聚合酶，每個(gè)反應(yīng)體積比為17.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5，共計(jì)23μL，20個(gè)反應(yīng)共計(jì)460μL，裝成1管；所述陰性對(duì)照為滅菌三蒸水，20個(gè)反應(yīng)共計(jì)2.0mL，裝成1瓶；所述陽(yáng)性對(duì)照為鳥類多瘤病毒陽(yáng)性質(zhì)粒，20個(gè)反應(yīng)共計(jì)40.0μL，裝成1管。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鳥類多瘤病毒PCR診斷試劑盒，其特征在于，所述鳥類多瘤病毒為鸚鵡鳥類多瘤病毒。

5.一種鳥類多瘤病毒PCR診斷試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下檢測(cè)步驟：

步驟1，DNA提取

子步驟1.1，待檢樣品DNA提取：吸取待檢樣品置入無菌離心管，加入裂解液，顛倒混勻，靜置裂解，加入無水乙醇，顛倒混勻，靜置沉淀，離心，棄去上清液，洗滌，棄去洗滌液，倒置無菌離心管，在空氣中自然干燥，用NaOH溶解，得待檢樣品DNA提取液；

子步驟1.2，陰性對(duì)照樣品提取：吸取滅菌三蒸水置入無菌離心管，加入裂解液，顛倒混勻，靜置裂解，加入無水乙醇，顛倒混勻，靜置沉淀，離心，棄去上清液，洗滌，棄去洗滌液，倒置無菌離心管，在空氣中自然干燥，用NaOH溶解，得陰性對(duì)照樣品提取液；

步驟2，PCR擴(kuò)增反應(yīng)

子步驟2.1，待檢樣品PCR擴(kuò)增反應(yīng)：取擴(kuò)增反應(yīng)混合液，加入所述待檢樣品DNA提取液，混合均勻，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件依次為95℃預(yù)變性反應(yīng)5min、94℃反應(yīng)30s、54℃反應(yīng)40s、72℃反應(yīng)40s，共進(jìn)行多個(gè)循環(huán)，最后再在72℃反應(yīng)10min，得待檢樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

子步驟2.2，陰性對(duì)照樣品PCR擴(kuò)增反應(yīng)：取擴(kuò)增反應(yīng)混合液，加入所述陰性對(duì)照樣品提取液，混合均勻，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件依次為95℃預(yù)變性反應(yīng)5min、94℃反應(yīng)30s、54℃反應(yīng)40s、72℃反應(yīng)40s，共進(jìn)行多個(gè)循環(huán)，最后再在72℃反應(yīng)10min，得陰性對(duì)照樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

子步驟2.3，陽(yáng)性對(duì)照樣品PCR擴(kuò)增反應(yīng)：取擴(kuò)增反應(yīng)混合液，加入鳥類多瘤病毒陽(yáng)性質(zhì)粒，混合均勻，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件依次為95℃預(yù)變性反應(yīng)5min、94℃反應(yīng)30s、54℃反應(yīng)40s、72℃反應(yīng)40s，共進(jìn)行多個(gè)循環(huán)，最后在72℃反應(yīng)10min，得陽(yáng)性對(duì)照樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

步驟3，電泳檢測(cè)

通過瓊脂糖凝膠電泳分別對(duì)所述待檢樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、陰性對(duì)照樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和陽(yáng)性對(duì)照樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，并進(jìn)行判斷。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鳥類多瘤病毒PCR診斷試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟2中，所述擴(kuò)增反應(yīng)混合液包含滅菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、APV-F上游引物、APV-R下游引物和rTaq DNA聚合酶。