[發明專利]一種禽腺病毒精純化的方法

有效

• 申請號: 201810359474.3
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN108531462B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 溫素彥;陳瑞愛;張淑瓊;馬光明;宋二保;張華;徐家華;廖世昌;吳達興
• 申請（專利權）人: 華南農業大學;肇慶大華農生物藥品有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 肖宇揚;付靜

本發明公開了一種禽腺病毒精純化的方法，包括步驟如下：1.取在細胞瓶中培養的雞胚細胞，進行病毒接種，并加入DMEM培養基，將細胞瓶置于37℃轉瓶培養箱中繼續培養，接毒后，收獲瓶內所有的病毒細胞培養液，經離心后收集上清液；2.使用超濾膜包對步驟1所獲得的上清液進行10?40倍濃縮；3.通過G200分子篩層析填料對步驟2所得液體進行分子篩層析；4.使用超濾膜包對步驟3回收的病毒液進行3?10倍濃縮；5.使用陰離子交換層柱對步驟4所得病毒液進行層析純化；6.使用超濾膜包對步驟5回收的病毒液進行4?10倍濃縮，得到純化后的禽腺病毒。本發明的純化方法可在保持病毒具有良好活性的前提下對病毒液中的雜蛋白進行高效純化，方便病毒的后續生物學應用。

技術領域

本發明涉及一種病毒精純化的方法，特別是涉及一種禽腺病毒精純化的方法。

背景技術

近年來，禽腺病毒(FAdV)在我國禽群中具有流行范圍越發廣泛、禽群感染率逐級升高的趨勢，由該類屬病毒引起的疾病發病率呈逐年上升，且危害性不斷增加。特別是由Ⅰ群禽腺病毒血清4型引起的心包積液-肝炎綜合征在全國多個省份的養雞場均有大規模暴發，造成雛雞的大量死亡，嚴重影響禽類養殖的生產效率，給我國養禽業帶來巨大的經濟損失。由于禽腺病毒疫情不可忽視，對禽腺病毒的防控刻不容緩。

腺病毒粒子呈二十面體對稱結構，無囊膜，病毒粒子直徑為70～90nm。腺病毒粒子具有252個衣殼粒，其中240個非頂角衣殼粒為六鄰體，12個頂角衣殼粒為五鄰體，每個五鄰體有兩條纖維突起。目前對禽腺病毒的防控主要采用禽腺病毒滅活疫苗等，而評價疫苗免疫效果的手段主要是監測免疫禽類體內的抗體水平。國內外研究人員已報道建立了很多用于禽腺病毒抗體檢測的ELISA方法，而這些研究報道均采用腺病毒的表達蛋白作為ELISA的包被抗原，但病毒在表達的過程中經過宿主修飾后，其表達蛋白的空間結構和有效抗原位點均與病毒的實際抗原位點差異巨大，造成了其檢測的抗體與疫苗實際產生的抗體具有很大差異，導致檢測效果的下降。為解決該問題采用全病毒作為ELISA包被抗原較為合適。

一般用于動物的病毒性疫苗多含有源于動物組織、細胞和培養基的蛋白質、糖類、脂類及核酸、以及細胞代謝副產物等雜質成分，這些物質與病毒的相互結合影響病毒的純度及滴度，進而導致疫苗效果降低。鑒于此，本發明針對細胞源禽腺病毒，根據其分子大小和帶電荷情況，針對性的去除絕大部分生物源性雜質成分，純化富集禽腺病毒抗原成分，獲得較純的腺病毒。

發明內容

本發明提供了一種禽腺病毒精純化的方法，以實現在不影響禽腺病毒活性的前提下對細胞源禽腺病毒進行純化。

本發明提供了一種禽腺病毒精純化的方法，包括步驟如下：

步驟1：取在細胞瓶中培養的雞胚細胞，棄去瓶內營養液，使用無菌PBS對瓶內雞胚細胞洗滌3次，按照每瓶1mL禽腺病毒培養液進行病毒接種，在37℃的條件下吸附1h后，棄去病毒液，加入DMEM培養基，將細胞瓶置于37℃轉瓶培養箱中繼續培養，接毒3d后，取出細胞瓶，反復凍融3次，收獲瓶內所有的病毒細胞培養液，將培養液在4000r/min的條件下離心30min，收集上清液；按照每次所需用量進行分裝，并凍存于-80℃的冰箱中；

步驟2：使用超濾膜包對步驟1所獲得的上清液進行10-40倍濃縮；

步驟3：對步驟2所得液體的蛋白含量和病毒含量進行測定；

步驟4：通過G200分子篩層析填料對步驟3所得液體進行分子篩層析，并使用1-3柱體積0.1M的PBS平衡層析柱，然后將步驟3所得病毒液上樣，并使用0.1M的PBS洗脫，依據280nm紫外光吸收值與時間關系圖，收集病毒吸收峰的樣品液，并按照步驟3的方法測定溶液中的蛋白含量與病毒含量；

步驟5：使用超濾膜包對步驟4回收的病毒液進行3-10倍濃縮，并按照步驟3的方法測定蛋白含量與病毒含量；

步驟6：使用陰離子交換層柱對步驟5所得病毒液進行層析純化，按照步驟3的方法測定蛋白含量與病毒含量；