[發明專利]一種禽腺病毒精純化的方法

有效

• 申請號: 201810359474.3
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN108531462B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 溫素彥;陳瑞愛;張淑瓊;馬光明;宋二保;張華;徐家華;廖世昌;吳達興
• 申請（專利權）人: 華南農業大學;肇慶大華農生物藥品有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 肖宇揚;付靜

1.一種禽腺病毒精純化的方法，其特征在于，所述精純化方法的步驟如下：

步驟1：取在細胞瓶中培養的雞胚細胞，棄去瓶內營養液，使用無菌PBS對瓶內雞胚細胞洗滌3次，按照每瓶1mL禽腺病毒培養液進行病毒接種，在37℃的條件下吸附1h后，棄去病毒液，加入DMEM培養基，將細胞瓶置于37℃轉瓶培養箱中繼續培養，接毒3d后，取出細胞瓶，反復凍融3次，收獲瓶內所有的病毒細胞培養液，將培養液在4000r/min的條件下離心30min，收集上清液；按照每次所需用量進行分裝，并凍存于-80℃的冰箱中；

步驟2：使用超濾膜包對步驟1所獲得的上清液進行10-40倍濃縮；

步驟3：對步驟2所得液體的蛋白含量和病毒含量進行測定；

步驟4：通過G200分子篩層析填料對步驟3所得液體進行分子篩層析，并使用1-3柱體積0.1M的PBS平衡層析柱，然后將步驟3所得病毒液上樣，并使用0.1M的PBS洗脫，依據280nm紫外光吸收值與時間關系圖，收集病毒吸收峰的樣品液，并按照步驟3的方法測定溶液中的蛋白含量與病毒含量；

步驟5：使用超濾膜包對步驟4回收的病毒液進行3-10倍濃縮，并按照步驟3的方法測定蛋白含量與病毒含量；

步驟6：使用陰離子交換層柱對步驟5所得病毒液進行層析純化，按照步驟3的方法測定蛋白含量與病毒含量；

步驟7：使用超濾膜包對步驟6回收的病毒液進行4-10倍濃縮，得到純化后的禽腺病毒，按照步驟3的方法測定蛋白含量與病毒含量；

所述步驟6中陰離子交換層析柱為Macro-prep High Q層析柱；

所述步驟6中使用陰離子交換層析對病毒進行純化的具體方法如下：

使用3個柱體積的0.01M PBS溶液對Macro-prep High Q陰離子交換層析柱進行平衡；取10mL步驟5所得濃縮病毒液，并加入2mL含0.5mol/LTris的樣品緩沖液稀釋后進行上樣，使用洗脫液對病毒進行純化，其中洗脫液由A液、B液混合得到，A液為1.5mol/LNaCl溶液，B液為0.025mol/LTris溶液，以含25％A液、75％B液的混合液作為初始洗脫液對層析柱進行沖洗，初始洗脫液體積為2個柱體積；待初始洗脫液用完后，以4個柱體積的A液對層析柱進行沖洗；對收集到液體進行紫外檢測，收集病毒吸收峰的樣品液，得到純化的病毒溶液。

2.根據權利要求1所述的禽腺病毒精純化的方法，其特征在于，所述步驟1中雞胚細胞為長成良好的單層CEF細胞。

3.根據權利要求1所述的禽腺病毒精純化的方法，其特征在于，所述步驟3中蛋白含量的測定方法為：

使用超微量紫外-可見光光度計，選定A280蛋白測量法，以BSA作為內標蛋白，以0.1M的PBS作空白對照組，每個樣品各測三次，記錄測量所得數據。

4.根據權利要求1所述的禽腺病毒精純化的方法，其特征在于，所述步驟3中病毒含量的測定方法為：

用滅菌的PBS溶液將收獲的禽腺病毒培養液按10倍梯度稀釋，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的四個稀釋度，每個稀釋度分別接種10枚9日齡SPF雞胚，按照每枚0.1mL病毒培養液進行病毒接種，將接種后的雞胚置于37℃溫箱中進行孵化，棄掉24h內死亡的雞胚，在孵化至72h后分別收集各稀釋度病毒培養液接種雞胚的尿囊液，利用Reed-Muench法對病毒EID50進行計算。

5.根據權利要求1所述的禽腺病毒精純化的方法，其特征在于，所述超濾膜包為100K的膜包。

6.根據權利要求1所述的禽腺病毒精純化的方法，其特征在于，所述病毒吸收峰的紫外檢測波長為280nm。

7.根據權利要求1所述的禽腺病毒精純化的方法，其特征在于，所述步驟1中DMEM培養基為含1％胎牛血清的高糖DMEM培養基。

8.根據權利要求1所述的禽腺病毒精純化的方法，其特征在于，所述精純化的方法還包括步驟8：取純化后的禽腺病毒按照0.5mL/管進行分裝，并置于-80℃的條件下保存。