[發明專利]一種單通道熒光成像檢測活性癌細胞中微量Ca2+

有效

• 申請號: 201810358113.7
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN108548804B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 曾晞;廖賢;方浚安;許萬里;田雁;牟蘭
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京聯創佳為專利事務所(普通合伙) 11362
• 代理人: 郭防;張梅

1.一種單通道熒光成像檢測活性癌細胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，其特征在于：是以經典杯[4]芳烴衍生物作為探針，通過單通道熒光成像分別檢測活性癌細胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺；所述的探針的化學結構式為：

2.如權利要求1所述的單通道熒光成像檢測活性癌細胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，其特征在于：所述的以經典杯[4]芳烴衍生物作為探針，通過單通道熒光成像分別檢測活性癌細胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺，是用探針和Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺分別對活細胞進行孵化，使探針和Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺先后分別進入細胞內，在細胞內結合生成探針-Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺配合物導致探針發出的熒光猝滅，用熒光倒置顯微鏡觀測孵化后的活細胞熒光像，具體方法為：

(1)活性Hela細胞經復蘇接種于含10％胎牛血清以及含1％雙抗RPMI 1640的培養基中，在溫度為37℃，5％CO₂及飽和濕度為100％的培養箱中培養，每隔2-3天傳代1次，選擇生長狀態良好的細胞接種于12孔板中培養，密度為2×10⁴個/ml，次日用新鮮培養基清洗細胞兩次；

(2)將步驟(1)中清洗后的Hela細胞浸入含25μM探針的培養液中，培養液的組成為98％培養基和2％N,N-二甲基甲酰胺，置于含5％CO₂的37℃恒溫培養箱內孵育90min，吸出含探針的培養液，用新鮮的RPMI Medium Modified培養基清洗細胞三次，置于熒光倒置顯微鏡下分別進行亮場和暗場拍照；熒光倒置顯微鏡的綠色通道下觀察染色后細胞的熒光圖像，綠色通道的激發波長為450nm～490nm，細胞呈現的綠色熒光，拍攝得到清晰的綠色熒光細胞輪廓影像；

(3)在上述(2)中細胞孔板內再分別加入0.5mL含60μM Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺溶液的培養液，培養液的組成為98％培養基和2％H₂O，在恒溫培養箱內孵育40min，進行細胞內探針對Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺染色，吸出含Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺溶液的培養液，用新鮮的RPMI Medium Modified培養基洗三次，置于熒光倒置顯微鏡的綠色通道下觀察探針對細胞內Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺染色后的熒光像，綠色通道的激發波長為450nm～490nm，細胞的綠色熒光猝滅，表明探針能在活性Hale細胞中檢測微量Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺離子。

3.如權利要求2所述的單通道熒光成像檢測活性癌細胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，其特征在于：所用活體Hale細胞是人體宮頸癌細胞；所用的拍照設備為熒光倒置顯微鏡。

4.如權利要求1或2所述的單通道熒光成像檢測活性癌細胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，其特征在于：所述的探針，是按下述合成路線合成的：

5.如權利要求1或2所述的單通道熒光成像檢測活性癌細胞中微量Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺的方法，其特征在于：所述的探針，是按下述步驟進行制備：

①中間體1的制備：

取對叔丁基苯酚，加入1000ml的三口圓底燒瓶中，然后按照對叔丁基苯酚：氫氧化鈉：37％甲醛水溶液為0.67mol：33.75mmol：80ml的比例依次向對叔丁基苯酚中加入氫氧化鈉以及37％甲醛水溶液，在氮氣流下吹出90％以上的水，加熱到110-120℃，機械攪拌1.5-2.5h后，停止反應，冷卻至室溫，按37％甲醛水溶液與二苯醚為80：500的體積比向其中倒入85℃的二苯醚，并繼續攪拌，將燒瓶中的混合物加熱回流，反應2.5-3.5h后，停止反應，冷卻至室溫，按二苯醚與乙酸乙酯為500：2000的體積比向燒瓶中加入乙酸乙酯，攪拌至白色沉淀析出，靜置，抽濾，并依次用乙酸乙酯、乙酸和蒸餾水各洗滌1次，共洗滌3次，干燥，即得白色粉末中間體1；

②中間體2的制備：

中間體1放入250ml圓底燒瓶中，按中間體1：甲苯：苯酚：無水AlCl₃為30.87mmol：150ml：154.3mmol：185.2mmol的比例依次向圓底燒瓶中加入甲苯、苯酚和無水AlCl₃，氮氣保護下室溫攪拌，反應3.5-4.5h后，將反應液倒入1M鹽酸水溶液中，依次用鹽酸溶液和水洗滌，分液，并蒸發掉溶劑，按甲苯與甲醇為1：1的體積比向所得固體中加入甲醇回流25-35min，冷卻抽濾，得到中間體2；

③中間體3的制備：

乙腈加入三口燒瓶中，按乙腈：中間體2：K₂CO₃為150ml：11.8mmol：12.92mmol的比例向裝有乙腈的三口燒瓶中依次加入中間體2和K₂CO₃，攪拌加熱回流25-35min后，按乙腈：溴乙酸乙酯為150：6的體積比向燒瓶中加入溴乙酸乙酯，攪拌加熱回流17-19h，反應混合物抽濾，濾液旋干，得到固體，用二氯甲烷溶解，用10％的鹽酸洗兩次，水洗滌兩次，分液，有機層用無水硫酸鈉干燥，旋干溶劑后，用氯仿溶解，再加入甲醇，重結晶得到無色固體中間體3；

④中間體4的制備：

在三口瓶中加入中間體3，按中間體3：干氯仿為1.23mmol：30ml的比例向三口瓶中加入干氯仿，室溫攪拌下，按中間體3：Cl₂CH₂OCH₃：TiCl₄為1.23mmol：25.42mmol：49.24mmol的比例依次加入Cl₂CH₂OCH₃和TiCl₄，室溫氮氣氛圍中反應18-20h，反應畢，將溶液倒入裝有冰的5％鹽酸溶液燒杯中，殘留在壁上的黑色固體用5％鹽酸洗滌兩次均倒入燒杯，攪拌，分層，分液，有機相用水洗滌兩次，無水硫酸鎂干燥，旋干溶劑，固體經硅膠柱分離，洗脫液是體積比為2：1的石油醚：乙酸乙酯，得無色固體中間體4；

⑤探針的制備

按中間體4：碘化氮甲基四甲基吡啶：甲醇：氯仿為1.56mmol：2.80mmol：40ml：10ml的比例將中間體4、碘化氮甲基四甲基吡啶、甲醇和氯仿置于三口瓶中，氮氣保護回流8-12min后，按甲醇與哌啶的體積比為40：0.3滴入哌啶回流2.5-3.5h，冷卻室溫，抽濾，固體分別用乙醚，甲醇，丙酮洗滌，得黃色固體，用丙酮重結晶，最后抽濾烘干得探針化合物。