[發明專利]獲得具有潰瘍性結腸炎治療作用的細胞亞群的培養方法

在審

• 申請號: 201810357257.0
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN108531451A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 王芝輝;王義國;譚毅;馬瑞萍
• 申請（專利權）人: 山東智康醫療科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 山東舜天律師事務所 37226
• 代理人: 李新海

本發明公開了一種獲得具有潰瘍性結腸炎治療作用的細胞亞群(CD90+CD105+)的培養方法，以自體骨髓為處理對象，包括以下步驟：(1)從成人骨髓中分離出單個核細胞，進行培養、擴增；(2)將培養的單個核細胞進行細胞因子活化刺激；(3)根據細胞生長情況，進行擴增傳代操作，20天后進行流式檢測細胞表型。本發明取骨髓進行單個核細胞分離，采用獨特的無血清培養基、自體血清添加物和細胞因子組合下進行干細胞的培養，記錄干細胞的增殖能力、檢測細胞的亞群含量。本發明能夠解決未經培養的干細胞中MSC比例低、增殖能力低的限制、擴增受限等問題。獲得具有高比例高效治療潰瘍性結腸炎能力的細胞亞群(CD90+CD105+)。

技術領域

本發明涉及一種干細胞的培養方法，特別涉及利用自體骨髓及相關細胞因子構建CD90+CD105+細胞擴增的優勢環境，獲得具高純度、高效治療潰瘍性結腸炎能力的細胞亞群(CD90+CD105+)的培養方法。

背景技術

骨髓的間充質干細胞是一種具有多向分化潛能的細胞，在特定的條件下，能誘導分化形成多種非造血組織細胞(如成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞等)。骨髓間充質干細胞能夠隨血液循環到達腸道，并定植于腸組織中，對受損的腸組織起到修復作用。

發明內容

針對上述現有技術，為了彌補潰瘍性結腸炎細胞治療中干細胞含量低的不足，本發明利用自體骨髓及相關因子構建(CD90+CD105+)細胞擴增的優勢環境，提供了一種步驟簡單、操作穩定的體外擴增培養干細胞、獲得具有高效治療潰瘍性結腸炎能力的細胞亞群(CD90+CD105+)的培養方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種獲得具有潰瘍性結腸炎治療作用的細胞亞群(CD90+CD105+)的培養方法，以自體骨髓為處理對象，包括以下步驟：

(1)從成人骨髓中分離出單個核細胞，進行培養、擴增；

(2)將培養的單個核細胞進行細胞因子活化刺激；

(3)根據細胞生長情況，進行擴增傳代操作，20天后進行流式檢測細胞表型。

優選的，所述步驟(1)的主要操作為：

①將采血袋或采血管經酒精浸潤的無塵紙擦拭潔凈后放入生物安全柜，抽取血袋或采血管中的骨髓分裝到50ml離心管中，每管骨髓30ml，經800g下離心10min；

②離心后，將上層清液置于一支新的50ml離心管中。吸至距分界面0.5cm處為止，若剩余骨髓細胞多于15ml，則取上層15ml骨髓細胞置于新的離心管中，棄去底部剩余細胞；

③用生理鹽水按照1∶1的比例稀釋細胞，取裝有15ml ficoll的離心管并傾斜，緩慢的將混勻的骨髓細胞加到ficoll液面上，使其呈清晰的界面，樣本與ficoll的比例不超過2∶1，于常溫低升降速，500g下離心20min；

④離心后液面將分為4層，從底部分別為紅細胞、ficoll層、白膜層和上清液層，吸棄上清液層，緩慢吸取白膜層細胞至新的50ml離心管中，加生理鹽水至45ml，混勻，500g下離心10min；

⑤離心后棄上清，細胞沉淀先用10ml生理鹽水重懸，再加生理鹽水至40ml，混勻，取樣用于細胞數量檢測、細胞亞群含量檢測，500g下離心10min；

⑥離心后棄上清，用淋巴細胞無血清培養基將細胞密度調整為1-2×10⁶/ml。

優選的，所述步驟(2)的主要操作為：

①用淋巴細胞無血清培養基將細胞密度調整為1-2×10⁶/ml，加入到培養瓶中，37℃、5.0％CO₂濃度培養箱中培養；