[發明專利]獲得具有潰瘍性結腸炎治療作用的細胞亞群的培養方法在審
| 申請號: | 201810357257.0 | 申請日: | 2018-04-20 |
| 公開(公告)號: | CN108531451A | 公開(公告)日: | 2018-09-14 |
| 發明(設計)人: | 王芝輝;王義國;譚毅;馬瑞萍 | 申請(專利權)人: | 山東智康醫療科技有限公司 |
| 主分類號: | C12N5/0775 | 分類號: | C12N5/0775 |
| 代理公司: | 山東舜天律師事務所 37226 | 代理人: | 李新海 |
| 地址: | 250101 山東省濟南市高*** | 國省代碼: | 山東;37 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 潰瘍性結腸炎 單個核細胞 細胞亞群 干細胞 擴增 增殖能力 治療 傳代 無血清培養基 細胞因子活化 添加物 成人骨髓 處理對象 細胞表型 細胞生長 細胞因子 自體骨髓 自體血清 檢測 流式 受限 亞群 骨髓 細胞 刺激 記錄 | ||
本發明公開了一種獲得具有潰瘍性結腸炎治療作用的細胞亞群(CD90+CD105+)的培養方法,以自體骨髓為處理對象,包括以下步驟:(1)從成人骨髓中分離出單個核細胞,進行培養、擴增;(2)將培養的單個核細胞進行細胞因子活化刺激;(3)根據細胞生長情況,進行擴增傳代操作,20天后進行流式檢測細胞表型。本發明取骨髓進行單個核細胞分離,采用獨特的無血清培養基、自體血清添加物和細胞因子組合下進行干細胞的培養,記錄干細胞的增殖能力、檢測細胞的亞群含量。本發明能夠解決未經培養的干細胞中MSC比例低、增殖能力低的限制、擴增受限等問題。獲得具有高比例高效治療潰瘍性結腸炎能力的細胞亞群(CD90+CD105+)。
技術領域
本發明涉及一種干細胞的培養方法,特別涉及利用自體骨髓及相關細胞因子構建CD90+CD105+細胞擴增的優勢環境,獲得具高純度、高效治療潰瘍性結腸炎能力的細胞亞群(CD90+CD105+)的培養方法。
背景技術
骨髓的間充質干細胞是一種具有多向分化潛能的細胞,在特定的條件下,能誘導分化形成多種非造血組織細胞(如成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞等)。骨髓間充質干細胞能夠隨血液循環到達腸道,并定植于腸組織中,對受損的腸組織起到修復作用。
發明內容
針對上述現有技術,為了彌補潰瘍性結腸炎細胞治療中干細胞含量低的不足,本發明利用自體骨髓及相關因子構建(CD90+CD105+)細胞擴增的優勢環境,提供了一種步驟簡單、操作穩定的體外擴增培養干細胞、獲得具有高效治療潰瘍性結腸炎能力的細胞亞群(CD90+CD105+)的培養方法。
本發明是通過以下技術方案實現的:
一種獲得具有潰瘍性結腸炎治療作用的細胞亞群(CD90+CD105+)的培養方法,以自體骨髓為處理對象,包括以下步驟:
(1)從成人骨髓中分離出單個核細胞,進行培養、擴增;
(2)將培養的單個核細胞進行細胞因子活化刺激;
(3)根據細胞生長情況,進行擴增傳代操作,20天后進行流式檢測細胞表型。
優選的,所述步驟(1)的主要操作為:
①將采血袋或采血管經酒精浸潤的無塵紙擦拭潔凈后放入生物安全柜,抽取血袋或采血管中的骨髓分裝到50ml離心管中,每管骨髓30ml,經800g下離心10min;
②離心后,將上層清液置于一支新的50ml離心管中。吸至距分界面0.5cm處為止,若剩余骨髓細胞多于15ml,則取上層15ml骨髓細胞置于新的離心管中,棄去底部剩余細胞;
③用生理鹽水按照1∶1的比例稀釋細胞,取裝有15ml ficoll的離心管并傾斜,緩慢的將混勻的骨髓細胞加到ficoll液面上,使其呈清晰的界面,樣本與ficoll的比例不超過2∶1,于常溫低升降速,500g下離心20min;
④離心后液面將分為4層,從底部分別為紅細胞、ficoll層、白膜層和上清液層,吸棄上清液層,緩慢吸取白膜層細胞至新的50ml離心管中,加生理鹽水至45ml,混勻,500g下離心10min;
⑤離心后棄上清,細胞沉淀先用10ml生理鹽水重懸,再加生理鹽水至40ml,混勻,取樣用于細胞數量檢測、細胞亞群含量檢測,500g下離心10min;
⑥離心后棄上清,用淋巴細胞無血清培養基將細胞密度調整為1-2×106/ml。
優選的,所述步驟(2)的主要操作為:
①用淋巴細胞無血清培養基將細胞密度調整為1-2×106/ml,加入到培養瓶中,37℃、5.0%CO2濃度培養箱中培養;
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