[發(fā)明專(zhuān)利]獲得具有潰瘍性結(jié)腸炎治療作用的細(xì)胞亞群的培養(yǎng)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810357257.0
• 申請(qǐng)日: 2018-04-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108531451A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王芝輝;王義國(guó);譚毅;馬瑞萍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山東智康醫(yī)療科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/0775
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 山東舜天律師事務(wù)所 37226
• 代理人: 李新海

1.一種獲得具有潰瘍性結(jié)腸炎治療作用的細(xì)胞亞群的培養(yǎng)方法，其特征在于：以自體骨髓為處理對(duì)象，包括以下步驟：

(1)從成人骨髓中分離出單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增；

(2)將培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞因子活化刺激；

(3)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，進(jìn)行擴(kuò)增傳代操作，20天后進(jìn)行流式檢測(cè)細(xì)胞表型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲得具有潰瘍性結(jié)腸炎治療作用的細(xì)胞亞群的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟(1)的主要操作為：

①將采血袋或采血管經(jīng)酒精浸潤(rùn)的無(wú)塵紙擦拭潔凈后放入生物安全柜，抽取血袋或采血管中的骨髓分裝到50ml離心管中，每管骨髓30ml，經(jīng)800g下離心10min；

②離心后，將上層清液置于一支新的50ml離心管中。吸至距分界面0.5cm處為止，若剩余骨髓細(xì)胞多于15ml，則取上層15ml骨髓細(xì)胞置于新的離心管中，棄去底部剩余細(xì)胞；

③用生理鹽水按照1∶1的比例稀釋細(xì)胞，取裝有15ml ficoll的離心管并傾斜，緩慢的將混勻的骨髓細(xì)胞加到ficoll液面上，使其呈清晰的界面，樣本與ficoll的比例不超過(guò)2∶1，于常溫低升降速，500g下離心20min；

④離心后液面將分為4層，從底部分別為紅細(xì)胞、ficoll層、白膜層和上清液層，吸棄上清液層，緩慢吸取白膜層細(xì)胞至新的50ml離心管中，加生理鹽水至45ml，混勻，500g下離心10min；

⑤離心后棄上清，細(xì)胞沉淀先用10ml生理鹽水重懸，再加生理鹽水至40ml，混勻，取樣用于細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)、細(xì)胞亞群含量檢測(cè)，500g下離心10min；

⑥離心后棄上清，用淋巴細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1-2×10⁶/ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的獲得具有潰瘍性結(jié)腸炎治療作用的細(xì)胞亞群的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟(2)的主要操作為：

①用淋巴細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1-2×10⁶/ml，加入到培養(yǎng)瓶中，37℃、5.0％CO₂濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

②將步驟(1)收集的標(biāo)本置于56℃，30min后，放入-20℃，10min，最終3000rpm，10min收集血清，制取獲得血清添加物；

③加入表皮生長(zhǎng)因子，終濃度為1000IU/ml，添加自體血清添加物濃度為5％，放入37℃，5.0％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

④24h后，更換培養(yǎng)基。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的獲得具有潰瘍性結(jié)腸炎治療作用的細(xì)胞亞群的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟(3)的主要操作為：

①根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，進(jìn)行補(bǔ)液操作，使細(xì)胞生長(zhǎng)密度保持在1-2×10⁷/ml；

②20天后，細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)、細(xì)胞亞群含量檢測(cè)。