[發明專利]棒狀桿菌誘導型啟動子及含有該啟動子的表達載體與應用

有效

• 申請號: 201810356892.7
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN108517321B
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 張成林;戰俊杰;王道安;李智祥;陳寧;孟靜;何繼龍;李英滋;朱福周;趙磊;徐慶陽;謝希賢;李燕軍;范曉光;馬倩
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/77;C12N1/21;C12P13/00
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 李蕊

1.一種棒狀桿菌誘導型啟動子P_iol，其特征在于：受肌醇誘導調控，其序列如SEQ IDNO:1所示。

2.一種棒狀桿菌誘導型表達質粒pIol，其特征在于：含有權利要求1所述的啟動子。

3.根據權利要求2所述的棒狀桿菌誘導型表達質粒pIol，其特征在于：是將權利要求1所述的啟動子插入至質粒pXMJ19的HpaⅠ和Hind Ⅲ酶切位點得到的，所述質粒pIol序列如SEQ ID NO:2所示。

4.一種用于生產5-氨基乙酰丙酸的質粒pIolhemAL，其特征在于：在權利要求2所述的表達質粒的BamHI和Kpn I酶切位點酶切位點插入谷氨酰-tRNA還原編碼基因hemA和谷氨酸-1-半醛-氨基轉移酶hemL，所述質粒pIolhemAL序列如SEQ ID NO:3所示，hemA序列如SEQID NO:4所示，hemL序列如SEQ ID NO:5所示。

5.一株5-氨基乙酰丙酸生產菌株，其特征在于：是由下述方法制備得到的：將權利要求1所述啟動子連同過表達的關鍵基因整合至宿主基因組，所述關鍵基因包括檸檬酸合酶編碼基因gltA、谷氨酸脫氫酶編碼基因gdh、轉氫酶基因pntAB以及蘇氨酸輸出載體rhtA，所述宿主為棒狀桿菌，并且，所述菌株含有權利要求4所述的用于生產5-氨基乙酰丙酸的質粒pIolhemAL。

6.權利要求5所述的5-氨基乙酰丙酸生產菌株，其特征在于：關鍵基因為檸檬酸合酶編碼基因gltA、谷氨酸脫氫酶編碼基因gdh、蘇氨酸輸出載體rhtA以及轉氫酶pntAB；其中，gltA序列如SEQ ID NO:6所示，gdh序列如SEQ ID NO:7所示，rhtA序列如SEQ ID NO:8所示，pntAB序列如SEQ ID NO:9所示。

7.一種應用權利要求5所述菌株發酵法生產5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于：利用所述5-氨基乙酰丙酸生產菌株生產5-氨基乙酰丙酸，具體步驟如下：

(1) 種子培養：將權利要求5所述的菌株活化后，接種至裝有1L 種子培養基的5L發酵罐，流加25% W/V的氨水調節發酵液pH至6.8-7.2，溶氧維持在10-20%，通風量1-3m³/h，攪拌轉速200-600rpm，32-37℃培養6-8h；

(2) 發酵罐發酵：以5%-10%接種量將步驟(1)的種子培養物接至裝有6L發酵培養基的10L發酵罐進行發酵培養，發酵溫度32-37℃，通風量3-5m³/h，攪拌轉速100-3000rpm，溶氧維持在10-20%，流加濃度為60-80% W/V的葡萄糖溶液，維持殘糖濃度為0.1-0.5% W/V ，流加25% W/V的氨水調節發酵液pH至6.8-7.2，發酵周期30-48 h；

(3) 種子培養基成分為 ：蔗糖 10-15g/L，玉米漿 15-25mL/L，酵母粉 1-6g/L，(NH₄)₂SO₄ 1-4 g/L，KH₂PO₄ 0.5-1.5g/L，MgSO₄ 0.1-0.5g/L， FeSO₄·7H₂O 0.01-0.05g/L，MnSO₄·H₂O 0.01-0.05g/L，pH 7.0，0.075MPa 高壓蒸汽滅菌15min；

(4) 發酵培養基成分為 ：葡萄糖 15-45g/L，玉米漿 5-15mL/L，豆餅水解液 5-15mL/L，(NH₄)₂SO₄ 8-20 g/L，生物素0.00004 g/L， pH 7.0-7.2，121℃高溫滅菌20min。